powrót do spisu treści

powrót do listy numerów archiwalnych

powrót do strony głównej

Niedojrzałe gamety męskie w technikach wspomaganego rozrodu

Ifran Aslam i Simon Fishel Centres for Assisted Reproduction, The Park Hospital, Sherwood Lodge Drive, Burntstump Country Park, Arnold, Nottingham NG5 8RX, Wielka Brytania. Tłumaczył Piotr Świrski

Wprowadzenie

Zapłodnienie u człowieka jest wstępnym etapem poczęcia, w trakcie którego poprzez szereg wzajemnych oddziaływań dochodzi do połączenia materiału genetycznego komórki jajowej i plemnika (syngamii) i powstania zygoty.

U zdrowego mężczyzny następujące kryteria pozwalają uznać nasienie za zdolne do zapłodnienia: 20-40 milionów plemników w mililitrze, z których ponad 50% wykazuje ruch prostolinijny i ponad 30% plemników w spermocytogramie nie wykazujących anomalii morfologicznych.¹

Zanim powstaną dojrzałe gamety zdolne do zapłodnienia, ich komórki macierzyste muszą ulec licznym przeobrażeniom.

We wczesnym okresie rozwoju zarodkowego pierwotne komórki rozrodcze wędrują z omoczni w okolicę ogonową jelita pierwotnego i zasiedlają okolicę zawiązka przyszłych gonad.

W okresie dojrzewania wyjściowe komórki macierzyste plemników, spermatogonie, zwiększają swoją liczbę za sprawą podziałów mitotycznych (faza mitotyczna), a następnie ulegają dwóm podziałom redukcyjnym (faza mejotyczna), w wyniku których, poprzez stadium spermatocytów I i II rzędu, powstają spermatydy. Komórki te, początkowo kuliste, w trakcie spermiogenezy zmieniają swój kształt. Przesuwanie się cytoplazmy wymusza zmiany w rozmieszczeniu i kształcie organelli, co prowadzi do wydłużenia długiej osi komórki (faza wydłużania spermatyd). Końcowym etapem spermiogenezy, w której przekształceniom ulegają tylko już uprzednio istniejące struktury, jest powstanie w pełni uformowanego plemnika.

Ciąg wszystkich zjawisk cytologicznych prowadzących do powstania z komórki macierzystej dojrzałego plemnika nazywamy spermatogenezą. Proces ten odbywa się – osiągnięciu dojrzałości płciowej – kanalikach nasieniotwórczych jąder.²

Wpływ na prawidłowy przebieg spermatogenezy i spermiogenezy mogą mieć zarówno czynniki genetyczne (mutacje), jak i niegenetyczne, takie jak: stres, infekcje, zaburzenia hormonalne, temperatura, toksyny.³

Zaburzenia mogą dotyczyć dowolnego etapu spermatogenezy, co może przejawiać się zmniejszoną liczbą dojrzałych plemników (oligospermia), nieprawidłową budową (teratozoospermia), czy też odchyleniami stwierdzanymi w czasie oceny ruchliwości plemników (astenozoospermia). U wielu pacjentów jednocześnie występują wszystkie te trzy anomalie.

W około 1-2% wszystkich przypadków niepłodności plemniki w ogóle się nie rozwijają i taki stan nazywamy azoospermią.

Biopsja jąder w diagnostyce niepłodności

Wyróżniamy następujące kategorie morfologiczne patologii, rozpoznawanych w materiale uzyskanym w biopsji jąder u niepłodnych mężczyzn: hipospermatogeneza, zatrzymanie dojrzewania, zespół samych komórek podporowych (Sertoliego), zespół Klinefeltera.

Hipospermatogeneza

Charakteryzuje się zmniejszoną dynamiką wszystkich etapów spermatogenezy w stopniu łagodnym, umiarkowanym lub ciężkim.³ Z nieznanych przyczyn wielu pacjentów z tą przypadłością wykazuje azoospermię.

Zatrzymanie dojrzewania

W tych przypadkach w większości kanalików nasieniotwórczych linie komórek rozrodczych osiągają wyłącznie stadium wczesne (spermatocytów) lub późne (spermatyd) spermatogenezy, przy czym poziom rozwoju u danego pacjenta jest jednakowy.

Przyczyna tego stanu rzeczy pozostaje nieznana. W niektórych przypadkach przypuszcza się, że zaburzenia genetyczne mogą wpływać na prawidłowe funkcjonowanie komórek macierzystych i komórek Sertoliego.

Receptor c-kit i jego ligand odgrywają ważną rolę w procesie odnowy spermatogonii z komórek pnia i ich dalszego różnicowania w trakcie podziałów redukcyjnych. Dlatego też mutacje w obrębie locus W, gdzie znajduje się gen kodujący receptor c-kit ⁴, bądź locus Sl, gdzie znajduje się gen kodujący ligand dla receptora c-kit ⁵, są być może odpowiedzialne za zaburzenia spermatogenezy w stadium zarówno przedmejotycznym, jak i wczesnego okresu spermatyd. Co więcej, wydaje się, że protoonkogen c-kit bierze udział w procesie wydłużania spermatyd.⁶

Prawdopodobnie nie wszystkie przypadki zespołu zatrzymania dojrzewania mają podłoże genetyczne. Jako jedną z możliwych przyczyn tego zaburzenia podaje się nieprawidłową stymulację gonadotropinami.

Badania Franchimont i wsp.⁷ wykazały, że u pacjentów z azoospermią, u których spermatogeneza nie osiągnęła stadium spermatyd, poziom FSH był wyraźnie podwyższony. W przypadku zatrzymania spermatogenezy powyżej etapu spermatyd, nie stwierdzono związku ze stężeniem FSH.

Inną odmianą zespołu zatrzymania dojrzewania jest zespół „zaburzonej organizacji jądra „dra” – „disorganized preparatach biopsyjnych obserwuje się kanaliki nasieniotwórcze zazwyczaj prawidłowej średnicy, czasem o pogrubiałych ścianach oraz prawidłowe komórki Leydiga. Odnajdujemy elementy wszystkich stadiów spermatogenezy, z tym, że młode niedojrzałe formy komórkowe przedwcześnie oddzielają się od nabłonka plemnikotwórczego i zapełniają, a czasem wręcz zatykają światło kanalików. Może to być przyczyną pomyłek co do stadium zatrzymania spermatogenezy, o ile nie uwzględni się komórek obecnych w świetle kanalików.

W taki sposób może wyrazić się efekt działania czynnika stresowego lub też urazu jąder. Ejakulat w takich przypadkach wykazuje najczęściej azoospermię lub obecność oderwanych młodych form komórkowych, które omyłkowo można uznać za leukocyty.⁸

Zespół samych komórek Sertoliego (podporowych)

W zespole tym w kanalikach nasieniotwórczych stwierdzamy obecność prawidłowych pod względem histologicznym komórek podporowych (Sertoliego) i całkowity brak elementów plemnikotwórczych. Wymiary kanalików są wyraźnie zmniejszone i często dochodzi do ich zwłóknienia. Nasienie tych pacjentów wykazuje azoospermię.⁸

W związku z tym, że proces chorobowy może dotyczyć tylko części tkanki jądrowej, ważne jest, aby materiał biopsyjny pobrać z odpowiedniej liczby miejsc z obu jąder.

Częstość występowania tego zespołu, przynajmniej w odniesieniu do jego postaci częściowej, jest stosunkowo duża. Na przebadanych 1294 niepłodnych mężczyzn wykryto ją w 2,7% przypadków. Wśród pacjentów z azoospermią zespół ten wykrywa się w około jednej trzeciej przypadków.¹⁰

Zespół Klinefeltera

W zespole tym w obrazie mikroskopowym obserwujemy postępującą utratę elementów plemnikotwórczych, zwłóknienie okołokanalikowe oraz nadmierny rozrost komórek śródmiąższowych (Leydiga). W końcowej fazie występuje rozlana hialinizacja (zeszkliwienie) błony podstawnej kanalików oraz brak komórek podporowych i macierzystych plemników. Stan ten bywa określany jako sclerosing tubular degeneration i spotyka się go u osobników z kariotypem 47xxy. W przypadku mozaicyzmu występuje częściowa spermatogeneza.

Z przedstawionych powyżej patologii każda może dotyczyć pacjentów, u których rozpoznano azoospermię, ale już na przykład biopsja u pacjenta z oligospermią nie wykaże cech zespołu Klinefeltera, czy też zespołu samych komórek Sertoliego. W tej grupie pacjentów będzie dominowała hipospermatogeneza.

Wśród mężczyzn z prawidłową liczbą plemników w ejakulacie, w badaniu histologicznym wycinków poza obrazem prawidłowym, możemy spotkać zatrzymanie dojrzewania lub hipospermatogenezę.³

W oparciu o przeprowadzoną analizę ilościową bioptatów udowodniono, że przy głęboko upośledzonej funkcji plemnikotwórczej jąder, jeśli nawet istnieją w nich nieliczne miejsca, gdzie funkcja ta jest w minimalnym stopniu zachowana, badanie nasienia w takich przypadkach wykaże całkowitą azoospermię.¹¹

W celu uzyskania materiału diagnostycznego wykorzystuje się technikę biopsji aspiracyjnej cienkoigłowej jąder. W uzyskanych tą drogą rozmazach łatwo możemy zidentyfikować poszczególne elementy kanalików nasieniotwórczych.¹²

Najważniejsze, aby w czasie badania mikroskopowego mieć na uwadze fakt, że poszczególne ogniska spermatogenezy, nawet w obrębie jednego kanalika, mogą wykazywać odmienne stopnie przebiegu (tak zwana fala spermatogenetyczna przyp. tł –

Czy możemy zatem na podstawie obrazu jednego wycinka postawić ostateczne rozpoznanie, częstokroć wykluczające możliwość zastosowania skutecznej terapii?

Techniki wspomaganego rozrodu

Początkowo w celu poprawienia skuteczności zapłodnienia in vitro cały wysiłek badaczy skupiał się na odtworzeniu niemal fizjologicznych warunków. Ejakulat musiał zawierać około 500 000 plemników wykazujących ruch prostoliniowy. Kryterium to uległo wkrótce zmianie z uwagi na to, że liczba plemników w nasieniu pacjentów z oligospermią, pomimo stosowania metod zagęszczania, była niewystarczająca.^13,14

Spojrzenie na problem roli czynnika męskiego w niepłodności uległo diametralnej zmianie z chwilą pojawienia się techniki ICSI (docytoplazmatyczne wstrzyknięcie plemnika)¹⁵, w której do zapłodnienia wystarcza obecność w nasieniu pacjenta niewielkiej liczby plemników, wykazujących powolne przemieszczanie się i małą amplitudę ruchu witki, czyli obraz charakterystyczny dla oligoastenozoospermii. Można ją również stosować w przypadkach astenoteratozoospermii, kiedy w spermocytogramie dominują nieprawidłowe morfologicznie formy plemników, wykazujące nieprawidłowy ruch.¹⁶ Także nasienie mężczyzn ze stwierdzoną azoospermią, po odwirowaniu przy 1800 g, może być wystarczające do zapłodnienia i uzyskania ciąży.¹⁷

Wśród przyczyn azoospermii wymienia się niedrożność dróg nasiennych lub zaburzenia spermatogenezy. W pierwszym przypadku w celu uzyskania w ejakulacie plemników zdolnych do zapłodnienia in vivo lub przynajmniej in vitro (za pomocą ICSI), wykonuje się zabiegi rekonstrukcji mikrochirurgicznej¹⁸.

Jeszcze do niedawna w przypadkach niepowodzeń leczenia operacyjnego, w nieoperacyjnych niedrożnościach, takich jak na przykład wrodzony brak nasieniowodów, rokowanie co do uzyskania własnego potomstwa było złe. Plemniki tych pacjentów uzyskiwane z najądrza charakteryzowały się niewielką zdolnością do zapłodnienia oraz niskim współczynnikiem płodności uzyskiwanym w czasie IVF.

Połączenie techniki ICSI z technikami PESA (Percutaneous epididymal-sperm aspiration), TESA (Testicular-sperm aspiration), MESA (microsurgical epididymal-sperm aspiration) sprawiło, że w chwili obecnej współczynnik płodności uzyskiwany w przypadku tych mężczyzn nie różni się od uzyskiwanego u pacjentów z prawidłową liczbą plemników w nasieniu.¹⁹

W przypadkach azoospermii spowodowanej niedrożnością, gdzie w ogóle nie jest możliwe uzyskanie ruchomych plemników z najądrza, połączenie technik ICSI i TESE (Testicular-sperm extraction) daje dobre rezultaty, zarówno jeśli chodzi o zapłodnienie, jak i o współczynnik płodności uzyskiwany w trakcie procedur IVF.^20,21

Zaburzenia spermatogenezy

Przypadłość ta nie poddaje się żadnej dotychczas stosowanej terapii. Próby stymulowania spermatogenezy u tych pacjentów za pomocą hormonów lub innych środków, a także podwiązywanie żylaków powrózka nasiennego nie przyniosły spodziewanych efektów. Podobnie rzecz się miała z takimi patologiami, jak zespół samych komórek Sertoliego, zatrzymanie dojrzewania, atrofia kanalików w następstwie wnętrostwa, orchitis parotidea czy zespół Klinefeltera.¹⁷ Jednak u większości tych pacjentów daje się stwierdzić za pomocą biopsji istnienie choć biopsji istnienie – choćby niewielu²¹, przynajmniej do wczesnych etapów spermiogenezy oraz obecność spermatyd.

Mikrowstrzyknięcie spermatydy przełcie spermatydy leczeniu niepłodności u mężczyzn

Rozwój nowej techniki zapłodnienia in vitro polegającej na wstrzyknięciu spermatydy do komórki jajowej w celu spowodowania normalnego poczęcia był możliwy dzięki następującym informacjom: spermatydy zawierają haploidalny zestaw chromosomowy i niemal całkowicie skondensowaną chromatynę, występujące w nich protaminy pełnią funkcję nukleoprotein, zaawansowane jest także powstawanie mostków dwusiarczkowych w resztach cysteinowych protamin.

Jak już wcześniej wspomniano, nawet w przypadkach hipospermatogenezy, zatrzymania dojrzewania, zespołów samych komórek Sertoliego czy Klinefeltera jesteśmy w stanie odnaleźć nieliczne miejsca tkanki jądrowej, gdzie występują przynajmniej wczesne etapy spermatogenezy i pojawiają się spermatydy.

Poza tym nie u wszystkich pacjentów, u których występuje zatrzymanie dojrzewania czy hipospermatogeneza z następową azoospermią, przyczyną tego stanu rzeczy jest czynnik genetyczny. Poza stresem, do niegenetycznych czynników sprawczych zaliczyć można infekcje, zaburzenia hormonalne, przegrzanie czy toksyny.³

Podobnie niektóre postacie zespołu samych komórek Sertoliego mogą być wywołane niepożądanym działaniem radio- i chemoterapii, długotrwałą estrogenoterapią, mogą także być zejściem wnętrostwa. Etiologia tego zespołu może być również nie znana.²²

U większości pacjentów z wymienionymi patologiami możliwe jest odnalezienie w tkance jądrowej spermatogenetycznie aktywnych ognisk, przynajmniej do wczesnych etapów spermiogenezy i pozyskanie tą drogą spermatyd.

W dotychczasowych rozważaniach padła sugestia, że w przypadku pacjentów z azoospermią spermatydy mogą być substytutem plemników w stosowanych technikach wspomaganego rozrodu.

W trakcie zapłodnienia następuje fuzja materiału genetycznego plemnika i komórki jajowej i powstaje haploidalna ootyda. Zostaje również dokończony drugi podział mejotyczny gamety żeńskiej, jako że oocyt przed zetknięciem się z plemnikiem – którego oba podziały redukcyjne dokonały się wcześniej - pozostawał zablokowany w metafazie drugiego podziału mejotycznego.²³

Docytoplazmatyczne wstrzyknięcie kulistych spermatyd –óre oba podziały redukcyjne mają za sobą i u których zamiana histonów na protaminy już się rozpoczęła – zapewnia najlepszyób przeniesienia męskiego haploidalnego DNA do oocytu. Procedura ta umożliwia ominięcie wszystkich etapów modyfikacji postmejotycznych, prowadzących w warunkach naturalnych do uzyskania takiej stabilizacji konstytucyjnej gamety męskiej, w której jest ona w stanie zachować nienaruszony materiał genetyczny w czasie przechowywania i wędrówki przez drogi rozrodcze męskie i żeńskie, a także w czasie wczesnych etapów procesu zapłodnienia: łączenia się z osłonką przezroczystą, zlania się z błoną komórkową oocytu i zamianą protamin na histony w oocycie.²⁴

Dlatego też zastosowanie ICSI może być postępowaniem z wyboru w leczeniu niepłodności u pacjentów z rozpoznanymi zespołami Klinefeltera i samych komórek Sertoliego, zatrzymaniem dojrzewania, atrofii kanalikowej będącej zejściem wnętrostwa oraz orchitis parotidea.

Pierwsze próby mikrowstrzyknięć wykonano u myszy i chomików^25,26, a doniesienia o żywych urodzeniach po zastosowaniu tej procedury dotyczyły myszy²⁷ i królików.²⁸

Następnie pojawiły się doniesienia o zakończonym sukcesem zapłodnieniu oocytu spermatydą²⁹ i uzyskaniu w ten sposób żywej ciąży u ludzi.²¹

Wprowadzenie ICSI oraz możliwość pozyskania spermatyd z ejakulatu³⁰ lub tkanki jądrowej²¹ przywróciło nadzieję wielu pacjentom, których niepłodność dotychczas nie poddawała się leczeniu.

Jednak jak z każdą nową metodą, tak i z tą wiążą się pewne nowe pytania i problemy, które trzeba rozwiązać. Omówienia wymagają kryteria biologiczne określające moment, w którym spermatydy mogą być zastosowane do leczenia niepłodności.^31,32

Udział plemnika w zapłodnieniu

Plemnik wnosi trzy podstawowe elementy warunkujące prawidłowy przebieg zapłodnienia: materiał genetyczny, centrosom oraz przypuszczalnie czynnik pochodzenia cytoplazmatycznego, zapoczątkowujący aktywację oocytu.

Materiał genetyczny

Materiał genetyczny występuje w formie kompleksu DNA i nukleoprotein. Spermatydy, podobnie jak dojrzałe plemniki, zawierają haploidalny zestaw chromosomów. Dlatego też młodsze formy linii komórek rozrodczych męskich, nawet na etapie kulistych spermatyd, zawierają dokładnie tę samą ilość DNA, co dojrzały plemnik.

Jednak proces przemiany spermatyd w plemniki zachodzi poprzez wyraźne zmiany jakościowe w składzie białek jądrowych: progresywnie usuwane histony zastępowane są protaminami (odwrotny proces – zamiany protamin na histony – ma zapłodnieniu w okresie powstawania przedjądrza męskiego).³³

Rodzi się pytanie, co się stanie, jeśli niedojrzałe jądro spermatyd, zawierające raczej kompleksy DNA z histonami a nie z protaminami, zetknie się z cytoplazmą oocytu?

Obecnie prowadzone prace badawcze nad płazami dowiodły, że całkowite usunięcie specyficznych histonów w plemniku nie jest konieczne do prawidłowego przebiegu zmian strukturalnych, zachodzących w jądrze po zapłodnieniu.³⁴ Co więcej, w odróżnieniu od innych ssaków, u których zasadniczo wszystkie histony w trakcie dojrzewania plemnika są zastępowane protaminami³⁵, u ludzi około 10% DNA występującego w dojrzałym plemniku wiąże się z histonami.³⁶ Jest zatem wielce prawdopodobne, że u człowieka całkowita zamiana histonów nie jest konieczna, aby po wstrzyknięciu spermatydy do oocytu powstało przedjądrze męskie.

Istotną modyfikacją epigenetyczną genów jest zachodzące w trakcie spermatogenezy zjawisko imprintingu genomowego.

W okresie embriogenezy aktywność genomu ojcowskiego i matczynego wykazuje pewne funkcjonalne zróżnicowanie, i tak: pierwszy konieczny jest do prawidłowego rozwoju tkanek pozazarodkowych, drugi zaś do wzrostu w okresie przedimplantacyjnym i embriogenezy.³⁷

Ponadto oba zestawy chromosomów warunkują dalszy prawidłowy rozwój płodu aż do porodu.³⁸

O ile w trakcie oogenezy i spermatogenezy chromosomy homologiczne są rozdzielane, to zachodzące przed zapłodnieniem modyfikacje w ich genach warunkują w późniejszych okresach rozwoju różną ich ekspresję.³⁹ Rolę w regulowaniu ekspresji genów przypisuje się procesowi metylacji DNA.⁴⁰

Największe obawy dotyczą właśnie ryzyka powstania ewentualnych nieprawidłowości w procesie imprintingu genomowego.

Jako przykład może posłużyć gen H19. Allel pochodzenia matczynego ulega transkrypcji, ojcowski nie.⁴¹ Reaktywację tego ostatniego zaobserwowano w niektórych przypadkach guza Wilma.⁴²

W ostatnio przeprowadzonych badaniach oceniając stan metylacji genu H19 od stadium spermatyd do stadium dojrzałych plemników u myszy i ludzi stwierdziliśmy, że imprinting genomowy jest ukończony przed drugim podziałem redukcyjnym.⁴³

Jest to wynik zgodny z wynikami prac Ogura i wsp ²⁷. Badania przeprowadzone na gryzoniach przez Kimura i Yanagimachi^44,45 oraz późniejsze obserwacje kliniczne wskazują, że zjawisko imprintingu genomowego jest ukończone przed drugim podziałem mejotycznym. Wnosimy stąd, że procedura mikrowstrzyknięcia spermatydy jest bezpieczna.

Wielu genom próbowano przypisać winę za zaburzenia procesu spermatogenezy. Scharakteryzowano i zmapowano dwa geny znajdujące się na długim ramieniu chromosomu Y w locus nazwanym AZF (azoospermia factor, czynnik azoospermii): gen Y RRM (gen motywu rozpoznającego RNA chromosomu Y)⁴⁶ oraz DAZ (deleted in azoospermia, ulegający delecji w azoospermii). ⁴⁷

Mikrodelecje lub mutacje w obrębie regionu AZF stwierdzono w niektórych przypadkach azoospermii.⁴⁸ In’t Veld i wsp.⁴⁹ wykazali, że u 5% pacjentów z azoospermią występowała delecja DAZ. Delecje regionu AZF/DAZ są przekazywane z ojca na syna.⁵⁰ W większości przypadków delecja DAZ skutkuje azoospermią, a w bioptatach spotykamy rozmaite stadia spermatogenezy od jej zupełnego braku do nagromadzenia spermatyd w kanalikach.⁴⁷

Nie wiemy, u jakiej części pacjentów z mikrodelecjami chromosomu Y spermatydy mogą być pozyskane do procedur wspomaganego rozrodu.

Jednak użycie takich spermatyd niczym nie grozi tak jeśycie takich spermatyd poczęcie, jak i o dalszy rozwój zarodka i płodu.⁵¹

W rzeczy samej, chociaż ten rodzaj zaburzeń genetycznych wpływa na rozwój i funkcje plemników, to pozostaje bez znaczenia jeśli chodzi o żywotność zarodków, z tym jednak zastrzeżeniem, że może on być przekazany na męskie potomstwo, jeśli zapłodnienia dokonamy metodą mikromanipulacji.

Centrosom

W procesie zapłodnienia u człowieka poza materiałem genetycznym plemnik wnosi również centrosom (ośrodek organizacyjny mikrotubul, ang. MTOC).

Chociaż sugerowano to już niemal sto lat temu,⁵² wciąż trwały dyskusje z uwagi na to, że u myszy centrosom jest pochodzenia matczynego. ⁵³ Obecnie wiemy, że u ludzi pochodzi on od ojca (a także u wszystkich dotychczas przebadanych ssaków, poza gryzoniami przyp. tłw, ⁵⁴

W skład centrosomu wchodzą dwie morfologicznie odrębne cylindryczne struktury – złożonej i niesymetrycznej budowie – zwane centriolami, wraz otaczającą je macierzą, z której powstają wrzeciona mikrotubul.⁵⁵

Po drugim podziale mejotycznym nowo powstałe spermatydy posiadają dwie centriole proksymalną dwie dystalną. W pobliżu bliższej powstaje cylindryczne wydłużenie znane jako centriolar adjunct, z dalszej rozwinie się witka plemnika.

W fazie wczesnych kulistych spermatyd centriole i podstawa witki przemieszczając się ku środkowi komórki, wchodzą w ściślejszy kontakt z tylnym biegunem jądra komórkowego w miejscu zwanym zagłębieniem implantacyjnym (implantation fossa). Występujące tu lokalne zgrubienie zewnętrznej powierzchni osłonki jądrowej określamy terminem płytki podstawowej.

Centriolar adjunct istnieje aż do późnego stadium spermiogenezy, po czym nagle znika. Jego rola nie została dotychczas poznana. Po powstaniu witki centriola dystalna ulega przekształceniom i na koniec przestaje istnieć jako osobna struktura.²

W konsekwencji dojrzały plemnik posiada tylko jedną centriolę. Ośrodek organizacyjny mikrotubul (MTOC) wnoszony podczas zapłrodek organizacyjny komórki jajowej, jest w zygocie odpowiedzialny za prawidłowe rozmieszczenie i funkcjonowanie mikrotubul, w tym, tworzących wrzeciona podziałowe podczas bruzdkowania.^55,54

Czynnik aktywacji oocytu

Powszechnie wiadomo, że uwolnione jony wapnia [Ca²⁺] wewnątrzkomórkowego są uniwersalnym przekaźnikiem sygnału powodującego aktywację oocytu,^56-58 wciąż jednak nie wiemy, w jaki sposób plemnik wywołuje te zmiany.

Oceniając wpływ mikrowstrzyknięć ekstraktów cytozolowych plemników do niezapłodnionych komórek jajowych chomika stwierdzono, że powoduje to seryjny wzrost stężenia jonów [Ca²⁺] i występowanie stanu naśladującego zapłodnienie. W oparciu o wyniki tych badań sformułowano przypuszczenie co do istnienia czynnika – zawartego cytoplazmie plemnika i uwalnianego podczas zapłodnienia powodującego aktywację odnienia⁵⁹

Podobne rezultaty uzyskano badając ludzkie komórki jajowe. ^58,60 Używając mikroskopu elektronowego stwierdzono, że brak oznak zapłodnienia po zastosowaniu ICSI, odnosił się w istocie do braku oznak aktywacji oocytu.⁶¹ Nasuwał się wniosek, że suboptymalny bodziec aktywacji oocytu może uniemożliwić dalszy rozwój zarodka. Praca Kimura i Yanagimachi⁴⁴ wykazała niezbicie, że stopień aktywacji oocytu wpływa na współczynnik płodności uzyskiwany metodą ICSI.

Największe wartości (77%) uzyskiwano wtedy, gdy oocyt przed mikrowstrzyknięciem spermatydy poddawany był stymulacji prądem elektrycznym. Wyniki uzyskiwane u ludzi po zastosowaniu ICSI, mierzone liczbą prawidłowych ciąż i urodzeń dowiodły, że cytoplazmatyczny czynnik obecny w plemniku występuje również w spermatydzie i wstrzyknięcie tej ostatniej powoduje aktywację oocytu.³⁰

Pobieranie, hodowla i przechowywanie niedojrzałych form plemników

Do celów proceduralnych spermatydy pozyskuje się bądź z nasienia, w którym pojawiają się w niektórych przypadkach azoospermii, bądź z tkanki jądrowej uzyskanej w czasie biopsji.

Materiał poddawany jest działaniu trypsyny i kolagenazy, w wyniku czego otrzymujemy mieszaninę komórek wywodzących się z linii komórek rozrodczych. Stosując metodę sedymentacji uzyskujemy jednorodne frakcje komórkowe z poszczególnych etapów spermatogenezy.⁶²

Podobną metodę można zastosować wobec bioptatów jądra u ludzi,⁶³ z tym, że frakcja zawierająca spermatydy będzie „zanieczyszczona” komórkami Leydiga, które mogą być usunięte przez odwirowanie zawiesiny w nieciągłym gradiencie Percolu, przez co uzyskujemy czystość rzędu 90-95% jeśli chodzi o zawartość kulistych spermatyd.⁶⁴

Początkowo nasze wysiłki koncentrowały się na opracowaniu metodologii pozyskiwania z tkanki jądrowej pacjentów z azoospermią dużych homogennych populacji spermatyd, ze szczególnym naciskiem na to, by zachowały one jak największą żywotność oraz zdolność do hodowli in vitro (w celu sprawdzenia postępu dojrzewania), konserwacji w niskich temperaturach, jak również do użycia ich w technikach wspomaganego rozrodu.^65,66

Wyniki uzyskane w materiale własnym dowodzą, że liczba spermatyd (miliony +/- odchylenie standardowe) uzyskanych z 1 grama tkanki jądrowej w przypadku pacjentów z azoospermią na tle niedrożności (n=8) była wyższa niż u pacjentów z azoospermią bez niedrożności (n=23): kuliste spermatydy 0,75+/-0,01 wobec 0,52+/-0,07 (P<0,001) z czystością 91%; spermatydy w fazie wydłużania 0,60+/-0,05 wobec 0,23+/-0,06 (P<0,001) z czystością 94% jeśli do segregacji komórek użyto techniki VSUG (Velocity Sedimentation Under Unit Gravity).

Jeśli używano techniki FACS (fluorescent activated cell sorter) również obserwowano większą średnią liczbę spermatyd (miliony +/- odchylenie standardowe) z grama tkanki jądrowej u pacjentów z azoospermią na tle niedrożności (n=9) w porównaniu do tych bez niedrożności (n=17) i tak: spermatydy kuliste 0,93+/-0,13 wobec 0,73+/-0,16 (P<0,005) z czystością 90%; spermatydy w fazie wydłużania 0,87+/-0,12 wobec 0,45+/-0,13 (P<0,001) z czystością 92%.

Z obu metod większą skutecznością w izolowaniu spermatyd u pacjentów z azoospermią na tle niedrożności wykazała się technika FACS (P<0,001), podobnie jak w przypadku pacjentów z azoospermią bez niedrożności (P<0,001).

Ponad 99% pozyskanych tą metodą spermatyd zachowuje żywotność. Metoda ta pozwala w krótkim czasie uzyskać dużą liczbę homogennych spermatyd.

Dlatego też w chwili obecnej jest to najbardziej użyteczna technika stosowana do izolowania spermatyd z bioptatów tkanki jądrowej. ⁶⁵

Prowadząc hodowlę w warunkach in vitro, bez względu na to czy jest to hodowla mieszaniny zawierającej nie rozdzielone frakcje linii komórek rozrodczych, czy też są to monokultury spermatyd kulistych, czy spermatyd w fazie wydłużania, możemy zaobserwować stopniową utratę żywotności w ciągu pierwszych 24 godzin, zaś po 72 godzinach ponad 90% komórek nie daje oznak życia.

Monokultury wykazują lepszą przeżywalność we wszystkich przedziałach czasowych hodowli (P<0,0005). Podczas gdy spermatydy w fazie wydłużania, podobnie jak inne komórki nie należące do linii komórek rozrodczych, nie wykazują w trakcie hodowli żadnych zmian morfologicznych, to u prawie 22% spermatyd kulistych wykształca się witka. W większości przypadków ma to miejsce w ciągu pierwszych 4-8 godzin hodowli. Monokultury kulistych spermatyd sprzyjały lepszemu wzrostowi witki (P<0,0005). ⁶⁶

Próby konserwacji niedojrzałych form plemników w niskich temperaturach także zakończyły się sukcesem, przy czym znowu monokultury wykazywały lepszą przeżywalność niż nie rozdzielona zawiesina (P<0,0005). ⁶⁶

Ostateczną weryfikacją żywotności ludzkich spermatyd było wstrzyknięcie ich do cytoplazmy oocytu. Porównywano skuteczność spermatyd pochodzących z ejakulatu oraz bezpośrednio z tkanki jądrowej uzyskanej w biopsji. Stosując ICSI z 207 oocytów zablokowanych w metafazie II podziału redukcyjnego do 64 wstrzyknięto kuliste spermatydy, do 92 spermatydy w fazie wydłużania, do 51 plemniki. Skuteczność zapłodnienia wyniosła odpowiednio 30, 24 i 64%.

W przypadkach, w których użyto spermatydy kuliste i te będące w fazie wydłużania –óżnice nie występowały. Miało znaczenie natomiast źródło pozyskania spermatyd i tak w przypadku nasienia użycie spermatyd kulistych dawało 33% powodzeń wobec 18% spermatyd w fazie wydłużania, zaś izolowane z bioptatów wykazywały odpowiednio 22% i 38% skuteczności. U trzech pacjentów porównywano, używając siostrzanych oocytów, działanie spermatyd kulistych i będących w fazie wzrastania znalezionych w nasieniu oraz plemników wyizolowanych z kanalików nasieniotwórczych. Zapłodnienie w przypadku spermatyd wynosiło 24%, w przypadku plemników 79%.⁶⁷

Wyniki kliniczne wstrzyknięcia spermatyd

Pierwsze doniesienie na temat zapłodnienia uzyskanego metodą mikrowstrzyknięcia ludzkiej spermatydy pochodzi od Vanderzwalmen i wsp. ²⁹

Używając “starszej” rozwojowo spermatydy (nie sprecyzowano z jakiego etapu spermatogenezy pochodzi) uzyskano normalne zapłodnienie. Nasza grupa opisała pierwszą ciążę¹⁴, zaś Tesarik i wsp. ³⁰ pierwsze narodziny dziecka po zastosowaniu powyższej procedury. W tym ostatnim przypadku spermatydy pochodziły z nasienia ojca. Raport na temat pierwszych narodzin dziecka po zapłodnieniu spermatydą wyizolowaną z kanalików nasieniotwórczych pochodzi z naszego ośrodka. ³²

Od tego czasu pojawiły się liczne publikacje pochodzące z klinik leczenia niepłodności, których wyniki świadczyły o skuteczności metody. Ze zgromadzonych danych wynika, że na ogólną liczbę 939 oocytów użytych w procedurze mikrowstrzyknięcia kulistych spermatyd uzyskano 412 zygot (43%), z których 295 (71%) uległo następowemu bruzdkowaniu.

Po transferze embrionów uzyskano 19 klinicznych ciąż i 15 prawidłowych porodów. Z 517 oocytów, wobec których użyto spermatyd w fazie wydłużania uzyskano 284 zygoty (54%), z których 197 (69%) uległo następowemu bruzdkowaniu, a po transferze embrionów uzyskano 13 klinicznych ciąż i 13 normalnych porodów.

W niektórych doniesieniach nie podano stadium rozwojowego spermatyd użytych w procedurze. Przyjmując to kryterium na ogólną liczbę 408 oocytów uzyskano 140 zygot (34%), z których 108 (77%) uległo następowemu bruzdkowaniu, a po transferze embrionów uzyskano 6 klinicznych ciąż i 5 żywych urodzeń.

Najważniejsze jest jednak to, że w żadnym z opisanych przypadków żywych urodzeń po zastosowaniu techniki mikrowstrzyknięcia spermatyd, nie stwierdzono zaburzeń chromosomalnych czy wad wrodzonych.

Wnioski

U niektórych mężczyzn jedynym źródłem haploidalnego materiału genetycznego mogącym posłużyć do ewentualnego rozrodu są niedojrzałe formy komórkowe plemników. Znajdujemy je bądź w ejakulacie bądź w bioptatach jąder, zatrzymane w rozwoju na jednym z wielu etapów pomiędzy fazą spermatyd kulistych a fazą wydłużania.

Obecnie wiemy, że istnieją pomiędzy wczesnym a późnym stadium spermatyd jedynie niewielkie różnice dotyczące relacji histony protaminy. Proces genomowego imprintingu jest ukończony przed drugim podziałce relacji ⁴³

Pozostałe kompetencje przypisywane plemnikom w zapłodnieniu są również udziałem spermatyd, o czym świadczą narodziny żywych i zdrowych dzieci.

Powodzenie procedury zapłodnienia metodą mikrowstrzyknięcia spermatydy zależy od trzech zasadniczych procesów: aktywacji oocytu, obecności centrosomu oraz odpowiednio sformowanego haploidalnego DNA.

Być może w przyszłości wstrzykiwany do cytoplazmy oocytu, pochodzący od ojca i zapewniający prawidłowy przebieg zapłodnienia „koktail będzie składał się koktail” będzie haploidalnego ojcowskiego DNA oraz odtworzonego i oczyszczonego oscyllogenu połączonego pozornie z centrosomem.

Wraz ze wzrostem wydajności metod pozyskiwania niedojrzałych form komórkowych plemników z bioptatów jądra⁶⁵ oraz rozwojem technologii przechowywania ich w niskich temperaturach⁶⁶ nadchodzi nowa era dla mężczyzn, którzy dotychczas nie mogli posiadać swojego genetycznego potomstwa z racji nie poddającej się leczeniu niepłodności.

powrót do spisu treści

powrót do listy numerów archiwalnych

powrót do strony głównej

powrót do spisu treści

powrót do listy numerów archiwalnych

powrót do strony głównej

Piśmiennictwo

1. WHO. WHO laboratory manual for examination of human semen and sperm-cervical mucus interaction 3rd edn. Cambridge University press: Cambridge. 1992

2. De Kretser DM, Kerr JB. The cytology of the testis. In: Knobil E. Neill J, Greenwald GS. Markest CL (eds.) Raven Press: New York,1994: 1177-1290

3. Colgan T J, Bedard YC. Strawbridge HTG, Buckspan MB, Klotz PG. Reappraisal of the value of testicular biopsy in the investigation of infertility. Fertil Steril 1980: 33: 56-60

3. Martin-de-Pan RC, Campana A. Physiopathology of spermatogenic arrest. Fertil Steril 1993; 60: 937-946

4. Chabot B, Stephenson DA, Chapman VM et al. The proto-oncogene c-kit encoding a transmembrane tyrosine kinase receptor maps to the mouse W locus. Nature 1988; 335: 88-89

5. Anderson DM, Lyman SD, Baird A et al. Molecular cloning of mast cell growth factor, a hematopoietin that is active in both membrane bound and soluble forms. Cell 1990; 63: 235-243

6. Albanesi C, Geremia R, Giorgio M et al. A cell and developmental stage-specific promoter drives the expression of a truncated c-kit protein during mouse spermatid elongation. Development 1996; 122: 1291-1302

7. Franchimont P, Millet D, Vendrely E. Letawe J, Legros JJ, Netter A. Relationship between spermatogenesis and serum gonadotrophin levels in azoospermia and oligospermia. J Clin Endocrinol Metab 1972; 34: 1003

8. Glezerman M. Etiology of fertility disturbances in man. In: Disturbances in male fertility. Springer-Verlag: Berlin. 1982

9. Dubin L, Amelar RD. Etiological factors in 1294 consecutive cases of male infertility. Fertil Steril 1971: 22: 469

10. Chandley AC, Edmond P, Maclean N, Fletcher J, Watson ES. Cytogenetics and infertility in man. Results of a five year survey of men attending an infertility clinic. II. Testicular histology and meiosis. Ann Hum Genet 1976; 40: 156

11. Silber SJ, Rodriguez-Rigau LI Quantitative analysis of testicular biopsy: determination of partial obstruction and prediction of sperm count after surgery for obstruction. Fertil Steril 1981; 36: 480-485

12. Rajwanshi A, Indudhara R, Goswami AK, Radhika S, Das A, Sharma SK, Vaidyanathan S, Datta BN. Fine needle aspiration cytology in azoospermic males. Diagnostic cytopathology 1991; 7: 3-6

13. Edwards RG, Fishel SB et al. Factors influencing the success of in-vitro fertilisation for alleviating human infertility. J In Vitro Fert Embryo Transfer 1984; 1: 3-23

14. Fishel S, Green S, Bishop M, Thornton S, Hunter A, Fleming S, Al-Hassan S. Pregnancy after intracytoplasmic injection of spermatid. Lancet 1995; 345: 1641-1642

15. Palermo G, Joris H, Devroey P, Van Steirteghem AC. Pregnancies after intracytoplasmic injection of single spermatozoon into an oocyte. Lancet 1992; 340: 17-18

16. Van Steirteghem AC, Nagy Z, Joris H et al. High fertilisation and implantation rates after intracytoplasmic sperm injection. Hum Reprod 1993; 8: 1061-1066

17. Silber SJ. What forms of male infertility are there left to cure. Hum Reprod 1995; 10: 503-504

18. Silber S J. Results of microsurgical vasoepididymostomy: role of epididymis in sperm maturation. Hum Reprod 1989; 4: 298-303

19. Silber SJ, Nagy ZP, Liu J, Godoy H, Devroey P, Van Steirteghem AC. Conventional in vitro fertilisation versus intracytoplasmic sperm injection for patients requiring microsurgical sperm aspiration. Hum Reprod 1994: 9: 1705-1709

20. Devroey P, Liu J, Nagy Z, Tournaye H, Silber SJ, Van Steirteghem AC. Normal fertilisation of human oocytes after testicular sperm extraction and intracytoplasmic sperm injection. Fertil Steril 1994; 62: 639-641

21. Silber SJ, Van Steirteghem AC, Liu J, Nagy Z, Tournaye H, Devroey P. High fertilisation and pregnancy rates after intracytoplasmic sperm injection with sperm obtained from testicle biopsy. Hum Reprod 1995; 10: 148-152

22. Schulze C. Sertoli cells and leydig cells in man. In: Advances in anatomy, embryology and cell biology, vol 88. Springer-Verlag: Berlin, Heidelberg, New York, 1984.

23. Austin CR. The mammalian egg. Blackwell scientific publications; Oxford, 1961

24. Edwards RG, Tarin JJ, Dean N, Hirsch A, Tan SL. Are spermatid injections into human oocytes now mandatory? Hum Reprod 1994; 9: 2217-2219

25. Ogura A, Yanagimachi R. Round spermatid nuclei injected into hamster oocytes form pronuclei and participate in syngamy. Biol Reprod 1993; 48: 219-225

26. Ogura A, Yanagimachi R, Usui N. Behaviour of hamster and mouse round spermatid nuclei incorporated into mature oocytes by electrofusion. Zygote 1993; 1: 1-8

27. Ogura A, Matsuda J, Yanagimachi R. Birth of normal young after electrofusion of mouse oocytes with round spermatid. Proc Natl Acad Sci 1994; 91: 7460-7462

28. Sofikitis N, Zavos P, Koutselinis A, Mourtzinis D, Loutradis D, Glanzounis G. Achievement of pregnancy after injection of round spermatid (RS) nuclei into rabbit oocytes and embryo transfer: a possible mode of treatment for men with spermatogenic arrest at the spermatid stage. J Urol 1994; 5(suppl): 151

29. Vanderzwalmen P, Lejeune B, Nijs M, Bertin GS, Vandamme B, Schoysman R. Fertilisation of an oocyte microinseminated with a spermatid in an in vitro fertilisation programme. Hum Reprod 1995; 10:502-503

30. Tesarik J, Mendoza C, Testart J. Viable embryos from injection of round spermatids into oocytes. The New England Journal Of Medicine 1995; 333: 525

31. Aslam I, Fishel S. The use of spermatids for human conception. In: Hansson V, Levy FO, Tasken K (eds.) Signal transduction in testicular cells. Springer-Verlag: Berlin, Heidelberg, New York, 1996; 271-286

32. Fishel S, Aslam I, Tesarik J. Spermatid conception: a stage too early, or a time too soon? Hum Reprod 1996; 11: 1371-1375

33. Perreault SD. Regulation of sperm nuclear reactivation during fertilisation. In: Bevister BD, Cummins J, Roldam ERS (eds.) Fertilisation in mammals. Serono symposia: Norwell 1990; 285-296

34. Itoh T, Ausio J, Katagiri C. Histone H l variant as sperm-specific nuclear protein of Rana catesbeiana, and their role in maintaining a unique condensed state of sperm chromatin. Mol Reprod Dev 1997; 47: 181-190

35. Meistrich ML. Histone and basic nuclear protein transition in mammalian spermatogenesis. In: Hnilica CS, Stein GS, Stein JL (eds.) Histones and other basic nuclear proteins. CRC press: Boca Raton, FL, USA, 1989; 165-182

36. Choudhary SK, Wykes SM, Mohamed AK et al. A haploid expressed gene cluster exists as a single chromatin domain in human sperm. J Biol Chem 1995; 270: 8755-8762

37. Barton SC, Surani MAH, Norris ML. Role of paternal and maternal genomes in mouse development. Naturę 1984; 311: 374-376

38. McGrath J, Solter D. Completion of mouse embryogenesis requires both the maternal and paternal genomes. Cell 1984; 37:179-183

39. Surani MZH. Evidences and consequences of differences between maternal and paternal genomes during embryogenesis in the mouse. In: eds? Experimental approaches to mammalian embryonic development. Cambridge University press: Cambridge.1986: 401-435

40. Cedar H. DNA methylation and gene expression. In: Razin A, Cedar H. Riggs AD (eds.) DNA methylation: biochemistry and biological significance. Springer-Verlag: New York, 1984; 147-164

41. Bartolomei MS. Zemel S, Tilghman SM. Parental imprinting of the mouse H19 gene. Nature 1991; 351: 153-155

42. Rainier S, Johnson LA, Dobry C J, Ping A, Grundy PA,

Feinberg AP. Relaxation of imprinted genes in human cancer. Naturę 1993; 362: 747-749

43. Aslam I, Scobie G, Fishel S. Genomic imprinting in the spermatogenic cells used for in-vitro fertilisation. Journal of Reproduction and Fertility 1996; Abstract series no. 18: l

44. Kimura Y, Yanagimachi R. Mouse oocytes injected with testicular spermatozoa or round spermatids can develop into normal offspring. Development 1995(a); 121: 2397-2405

45. Kimura Y, Yanagimachi R. Development of normal mice from oocytes injected with secondary spermatocyte nuclei. Biology of Reproduction 1995(b); 53: 855-862

46. Ma K, Inglis JD, Sharkey A, Bickmore WA, Hill RE, Prosser EJ, Speed RM, Thomson EJ, Jobling M, Taylor K, Wolfe J, Cooke HJ, Hargreave TB, Chandley AC. A Y chromosome gene family with RNA-binding protein homology: candidates for azoospermia factor AZF controlling human spermatogenesis. Cell 1993; 75: 1287-1295

47. Reijo R. Lee TY, Salo P, Alagappan R et al. Diverse spermatogenic defects in humans caused by Y chromosome deletions encompassing a novel RNA-binding protein gene. Naturę Genet 1995; 10: 383-392

48. Qureshi S J. Ross AR. Ma K et al. Polymerase chain reaction screening for Y chromosome microdeletions: a first step towards the diagnosis of genetically determined spermatogenic failure in men. Mol Hum Reprod 1996; 2: 775-779

49. In’t Veld PA, Halley DJJ, Hemel JOV Niermeijer MF, Dohle G, Weber RFA. Genetic counselling before intracytoplasmic sperm injection. Lancet 1997; 350: 490

50. Vogt PH, Edelmann A, Kirsch S et al. Human Y chromosome azoospermia factors (AZF) mapped to different subregions in Yql 1. Hum Molec Genet 1996; 5: 933-943

51. Mulhall JP, Reijo R, Alagappan R, Brown L. Page D, Carson R, Oates RD. Azoospermic men with deletion of the DAZ gene cluster are capable of completing spermatogenesis: fertilisation, normal embryonic development and pregnancy occur when retrieved testicular spermatozoa are used for intracytoplasmic sperm injection. Hum Reprod 1997; 12: 503-508

52. Boveri T. Zellen-studien: uber die natur der centrosomen IV. Jena: Germany, 1901

53. Schatten G, Simerly C, Schatten H. Maternal inheritance of centrosomes in mammals? Studies on parthenogenesis and polyspermy in mice. Proc Natl Acad Sci USA 1991; 88: 6785-6789

54. Simerly C, Wu G, Zoran S et al. The paternal inheritance of the centrosome, the cell’s microtubule-organising centre, in humans and the implications for infertility. Nature medicine 1995: 1:47-52

55. Palermo G, Munne S, Cohen J. The human zygote inherits its mitotic potential from the male gamete. Hum Reprod 1994; 9: 1220-1225

56. Vitullo AD. Ozil JR Repetitive calcium stimuli derive meiotic resumption and pronuclei development during mouse oocyte activation. Developmental biology 1992; 151: 128-136

57. Homa ST. Carroll J, Swann K. The role of calcium in mammalian oocyte maturation and egg activation. Hum Reprod 1993: 8:l274-1281

58. Tesarik J. Sousa M. Testart J. Human oocyte activation after intracytoplasmic sperm injection. Hum Reprod 1994; 9: 511-518

59. Swann K. A cytosolic sperm factor stimulates repetitive calcium increases and mimics fertilisation in hamster eggs. Development 1990: 110: 1295-1302

60. Dozortsev D. Rybouchkin A, DeSutter P, Qian C, Dhont M. Hurnan oocyte activation following intracytoplasmic injection: the role of the sperm cell. Hum Reprod 1995; 10: 403-407

61. Sousa M. Tesarik J. Ultrastructural analysis of fertilisation failure after intracytoplasmic sperm injection. Hum Reprod 1994; 9: 2374-2380

62. Bellve R A. Purification, culture and fractionation of spermatogenic cells. Methods in enzymology 1993; 225: 84-113

63. Shepherd WR, Millette FC, DeWolf GW Enrichment of primary pachytene spermatocytes from the human testes. Gametę research 1981; 4: 487-498

64. Narayan P, Scott BK, Millette CF, DeWolf WC. Human spermatogenic cell marker proteins detected by two-dimensional electrophoresis. Gamete Research 1983; 7: 227-239

65. Aslam I Robins R A, Dowell K, Fishel S. Isolation, purification and assessment of viability of spermatogenic cells from testicular biopsies of azoospermic men. Hum Reprod 1998;in press.

66. Aslam I, Fishel S. Short-term in-vitro culture and cryopreservation of spermatogenic cells used for human in-vitro conception. Hum Reprod 1997; in press.

67. Fishel S, Green S, Hunter A, Lisi F, Rinaldi L, Lisi R, McDermott H. Human fertilisation with round and elongated spermatids. Hum Reprod 1998; 12: 336-340

powrót do spisu treści

powrót do listy numerów archiwalnych

powrót do strony głównej