powrót do spisu treści

powrót do listy numerów archiwalnych

powrót do strony głównej

Minisympozjum: Łożysko

Apoptoza komórek łożyska w ciąży prawidłowej i powikłanej

S. C. Smith, Research Fellow, P. N. Barker, Senior Lecturer, School of Human Development, Academic Department of Obstetrics & Gynaecology, New Maternity Unit, City Hospital, Hucknall Road, Nottingham NG5 1PB, Wielka Brytania. Tłumaczyła Lidia Michalak

WSTĘP

Do niedawna temat śmierci komórki uważano za nudny i wręcz chorobliwy. Zjawiska patologiczne rozpatrywano raczej w kategoriach nadmiernego wzrostu komórek niż w aspekcie zaburzeń procesu ich umierania.¹ Czasy się zmieniły i zagadnienie śmierci komórki stało się modne z różnych powodów. Między innymi uświadomiliśmy sobie, że wielu z nas umiera na skutek bezpośredniej śmierci komórek, do której dochodzi np. w wyniku zawału. Innym ważnym bodźcem dla badań nad śmiercią komórki stało się coraz częstsze przeszczepianie narządów i konieczność zrozumienia na czym polega żywotność narządu.

Śmierć komórki zachodzi w różnych okolicznościach, w pewien sposób przypominających te znane nam z codziennego życia:

- w wypadku przypadkowa śmierć wypadku wyniku jakiejś patologii np. niedostarczenie krwi,

- poprzez samobójstwo: potrafi to każdy rodzaj komórki,

- na skutek wykonania wyroku przez wyspecjalizowane komórki-zabójców (killer cells).

Znamy dwie główne formy śmierci komórki. Najczęściej śmierć komórki jest wynikiem nieodwracalnego jej uszkodzenia, brak substancji odżywczych lub brak tlenu. Ten rodzaj śmierci komórki można uznać za przypadkową śmierć komórki. W praktyce tylko jeden rodzaj przypadkowej śmierci komórki jest dobrze poznany - jest to śmierć komórki na tle niedokrwienia, której towarzyszy obrzęk komórkowy. Ta forma śmierci nazywana jest onkozą (oncosis, z greckiego: onkos, obrzęk), a pojęcie to wprowadził prawie sto lat temu von Recklinghausen. Drugą główną formą śmierci komórki jest “samobójstwo”, czyli apoptoza (apoptosis). Śmierć z wyroku wykonanego przez komórki-zabójców odbywa się także w mechanizmie apoptozy.

Wczesną śmierć komórki (podobnie jak śmierć kliniczną) trudno jest rozpoznać i nie ma jednego prostego sposobu, aby dokładnie dowiedzieć się, kiedy komórka umiera. Jeśli komórka pozostaje martwa przez pewien czas (12-24 godzin), przechodzi serię wtórnych zmian morfologicznych, jak np. rozpad jądra komórkowego jest to proces martwicy. Martwicę łatwo jest rozpoznać rkowego mikroskopie świetlnym, jednak zidentyfikowanie komórek które obumarły przed chwilą jest trudne. Nie należy mylić onkozy z martwicą. Na martwicę składa się szereg zjawisk wtórnych, które zachodzą w jakiś czas po śmierci komórki. Stwierdzić, że komórka umiera w wyniku martwicy to tak, jakby powiedzieć, że śmierć pacjenta następuje w wyniku pośmiertnej autolizy.

TŁO HISTORYCZNE

Po raz pierwszy apoptozę (programowaną śmierć (“programowaną”órki / samobójstwo komórki) opisali Kerr, Wylie i Currie w przełomowej pracy z 1972 roku,² ale hipotezę śmierci komórki w postaci innej niż onkoza Kerr wysunął już w 1965 roku.³ Opisał on formę śmierci komórki, która różniła się od obrzękniętych komórek spotykanych w onkozie, i nadał temu zjawisku wstępną nazwę shrinkage necrosis martwica przez obkurczanie. Apoptoza jest podstawowym zjawiskiem biologicznym, wystę “shrinkage necrosis” różnych stanach fizjologicznych i patologicznych. Pomimo że po raz pierwszy została opisana ćwierć wieku temu, dopiero stosunkowo niedawno zaakceptowano ją w środowisku medycznym i naukowym. Pierwsza międzynarodowa konferencja poświęcona apoptozie (Czynniki modulujące wielostopniowej chemicznej karcynogenezy) odbyła sicona na Sardynii we wrześniu 1989 roku.⁴ Idea apoptozy, czyli założenie, że śmierć wybranych pojedynczych komórek w tkance może być aktywnym procesem odbywającym się za pośrednictwem własnych biochemicznych mechanizmów tych komórek, jest przez niektórych⁴ uznawana za jedno z przełomowych odkryć w badaniach nad komórką i tkanką w tym stuleciu. Termin apoptoza wywodzi się z greckiego określenia opadania płleniaów z kwiatów lub liści z drzew. Przed opisem apoptozy każdą śmierć komórki uważano za wynik pewnej formy urazu z zewnątrz i uznawano za onkotyczną w swoim charakterze. Doniesienia na temat apoptozy w tkankach łożyska zaczęły pojawiać się w literaturze dopiero w ciągu ostatnich dwóch lat.^5,6

APOPTOZA I ONKOZA

Choć martwe komórki czasami trudno jest zidentyfikować, doświadczony obserwator z łatwością rozpozna w mikroskopie świetlnym komórki, które przeszły apoptozę. Pomaga w tym ich typowa morfologia (patrz rycina 1).

Najbardziej charakterystyczną cechą apoptozy w mikroskopie świetlnym jest kondensacja heterochromatyny jądrowej, początkowo w postaci półksiężyca przylegającego do błony jądrowej, potem w postaci pojedynczych lub mnogich gęstych ciałek. Przy pewnej praktyce można to wykryć konwencjonalną metodą oglądając w mikroskopie świetlnym z impresją komórki barwione hematoksyliną i eozyną. Przy braku rozstrzygającego markera molekularnego badanie morfologiczne jest najlepszym sposobem identyfikacji apoptozy. Jednak najbardziej charakterystyczną morfologię najlepiej ujawnia badanie w mikroskopie elektronowym, które jest pewnym potwierdzeniem apoptozy.⁷ Rycina 2 przedstawia porównanie apoptozy i onkozy.

Śmierć komórki przez apoptozę opisywano w różnych sytuacjach.⁸ Odgrywa ona ważną rolę w embriologii i biologii rozwojowej, czego dobrym przykładem jest inwolucja przewodów Mullera i Wolffa. Apoptoza uczestniczy również w atrofii w pełni rozwiniętych tkanek u ssaków po usunięciu stymulacji hormonalnej, czego przykładem są gruczoły sutkowe po okresie laktacji. Proces ten równoważy także mitozę w pobudzanych nabłonkach, jak np. w ludzkim endometrium. W pewnym stopniu apoptoza musi zachodzić we wszystkich tkankach. Występuje również w tkankach poddawanych działaniu różnych toksycznych bodźców, szczególnie gdy te występują w małych dawkach np. leki cytotoksyczne, promieniowanie jonizujące, hipertermia i hipoksja.

Ryc. 3. Molekularny mechanizm apoptozy

Molekularne mechanizmy apoptozy badał ostatnio Tanum.⁹ Rycina 3 przedstawia ich schemat. Indukcja śmierci w mechanizmie apoptozy polega na tym, że komórki otrzymują sygnały odbierane przez specjalne receptory na powierzchni komórki. Znane są dwa receptory zlokalizowane na powierzchni komórek odpowiedzialne za inicjowanie procesu apoptozy:

1. Fas/APO-1 biał1. Fas/APO-1 –órki oraz

2. receptor czynnika martwicy nowotworów (TNF-R).

Podczas przekazywania sygnału w błonie komórkowej powstają wtórne przekaźniki (cAMP, cGMP itd.), wytwarzane przez cyklazę adenylową i cyklazę guanylową. Nie poznano jeszcze wszystkich zjawisk, jakie zachodzą po pobudzeniu tych receptorów, ale interakcje wtórnych przekaźników powodują uaktywnienie genów regulatorowych apoptozy, aktywację istniejących uprzednio produktów genów apoptozy i/ lub supresję ekspresji genów przeżycia. Komórka zdolna do apoptozy potrafi kierować procesami zapewniającymi przeżycie aż do momentu determinacji. W procesie determinacji komórki przechodzą przez “punkt bez powrotu” do apoptozy. Wykazano, że w tych zjawiskach ważną rolę pełni kilka onkogenów (c-myc, p53, bcl-2, c-fos itd.). Zarówno proces indukcji jak i determinacji apoptozy mają różny przebieg w różnych rodzajach komórek i w różnych stanach czynnościowych komórki. Gdy jednak program apoptozy zostanie już uruchomiony, jej zrealizowanie (egzekucja) przebiega nieodwracalnie we wspólnym mechanizmie.

W różnych komórkach wczesne stadia apoptozy cechuje stałe, wysokie wewnątrzkomórkowe stężenie wapnia (Ca²⁺). Czynnik ten może wyzwalać aktywację jądrowej endonukleazy, specyficznej dla apoptozy, która rozszczepia DNA genomu w miejscach wiązań między nukleosomami (nukleosomy cząsteczki białdzy nukleosomami które nawinięty jest łańcuch DNA) i prowadzi do powstania oligomerów nukleosomalnych. Każdy nukleosom ma związanych ze sobą 180 par zasad. Oligomery składają się z wielokrotności tych 180 par zasad. Aktywowane są również proteazy przypominające ICE (enzym konwertujący interleukinę), karpaina, oraz tkankowa transglutaminaza działająca na białka cytoplazmy. Ta seria zjawisk, składających się na proces egzekucji, przekształca komórkę do nieodwracalnego stanu apoptozy. Komórki dotknięte apoptozą lub ich fragmenty (ciałka apoptotyczne) są szybko rozpoznawane i fagocytowane przez makrofagi lub komórki sąsiednie. Tak więc apoptoza jest mechanizmem śmierci komórek, ale jest też mechanizmem oczyszczania komórek. Cały proces trwa bardzo krótko, a jego ukończenie zajmuje tylko 1-2 godziny.⁸

Apoptoza jest procesem wymagającym energii i może zależeć od ekspresji nowego genu w następstwie indukcji. W prawidłowych limfocytach może być hamowana przez inhibicję RNA lub syntezę protein, co sugeruje, że progresja apoptozy wymaga transkrypcji i translacji pewnych genów, w tym białek aktywatorów. Inaczej jest w przypadku neutrofili, komórek krypt żołądkowo-jelitowych i pewnych innych typów komórek, gdzie apoptozę szybko wzbudzają inhibitory RNA lub synteza białek. W tych sytuacjach, jak się uważa, mechanizm apoptozy jest już zapoczątkowany, a jego działanie mogą hamować białka inhibitorowe o krótkim okresie półtrwania.

APOPTOZA W ŁOŻYSKU LUDZKIM

Badania prowadzone w ciągu ostatnich 18 miesięcy w Nottingham poświęcono zagadnieniu apoptozy komórek łożyskowych. Wstępną, przewodnią hipotezą badań było przypuszczenie, że apoptoza może występować z większym nasileniem w łożyskach z ciąż powikłanych wewnątrzmacicznym zahamowaniem wzrostu płodu (IUGR intrauterine growth retardation) niż odu łożyskach z ciąż prawidłowych, powodując w efekcie ograniczenie wielkości łożyska i co się z tym wiąże mniejszą masę ciała dziecka. Projekt badawczy miał trzy główne cele:

1. Wykazać w sposób definitywny apoptozę w tkankach łożyska ludzkiego

2. Znaleźć ewentualne różnice w częstości występowania apoptozy w przebiegu ciąży

3. Znaleźć ewentualne różnice w częstości występowania apoptozy w łożyskach w ciążach powikłanych przez IUGR

Do zidentyfikowania przypadków IUGR wykorzystano trzy kryteria:

1. kliniczne cechy nieprawidłowego wzrostu,

2. dowody na odchylenie od właściwego centyla wzrostu w badaniu ultrasonograficznym

3. wartości zindywidualizowanych wskaźników masy urodzeniowej (IBRs – Individualized Birthweight Ratios) poniżej dziesiątego centyla.

IBR wskazuje przewidywaną prawidłową urodzeniową masę ciała. IBR oblicza się na podstawie niezależnych współczynników

a. wieku ciąży w chwili rozwiązania,

b. płci płodu,

c. liczby ciąż w wywiadzie,

d. pochodzenia etnicznego,

e. wzrostu i należnej masy ciała matki.

IBR jest dokładniejszym wskaźnikiem prognostycznym w przypadkach ciąż o niepomyślnym rokowaniu niż sama masa urodzeniowa dla danego wieku ciążowego.¹⁰ IUGR może być powikłaniem różnych stanów klinicznych i próby określenia jednego procesu patologicznego, który tłumaczyłby opóźniony wzrost płodu w tak różnych sytuacjach klinicznych jak wady macicy, ciąża mnoga czy stan przedrzucawkowy, byłyby nierealistyczne. Łożyska pochodzące z ciąż powikłanych IUGR częściej są mniejsze niż łożyska pochodzące z prawidłowych nie powikłanych ciąż^11,13 i przypuszczalnie składają się z mniejszej liczby komórek. Czy apoptoza odgrywa jakąś rolę w patofizjologii IUGR?

MATERIAŁ I METODA

Próbki tkanek łożyska uzyskiwano w I trymestrze (31 przypadków), w II trymestrze (11 przypadków), oraz w III trymestrze ciąży o przebiegu fizjologicznym (43 przypadki) i powikłanym IUGR (26 przypadków). Materiał z pierwszego i drugiego trymestru pobierano po przedwczesnym zakończeniu ciąży, gdy uznano, że nie ma on zmian patologicznych. Próbki łożysk z  III trymestru zebrano w oddziale położniczym Szpitala Miejskiego w Nottingham. Materiał pochodził zarówno z porodów drogami natury (samoistnych i indukowanych) jak i z cięć cesarskich. Unikano próbek popłodów z porodów zakażonych, ponieważ obszary ostrego zapalenia (jakie występują w zapaleniu błon płodowych) zawierają dużo apoptotycznych neutrofili. Wszystkie próbki szybko utrwalano.

Ocena w mikroskopie świetlnym

Preparaty oceniane przy pomocy mikroskopu świetlnego utrwalano płynem Carneya, albo 10% formaliną. W mikroskopie świetlnym oceniano wszystkie próbki. Po utrwaleniu każdą próbkę zanurzano w parafinie i skrawki o grubości 4 mm umieszczano na szkiełkach podstawnych. Z każdej próbki przygotowywano 5 skrawków. Skrawki te wycinano z różnych fragmentów tkanki z jednego łożyska, aby mieć pewność, że badane preparaty są wybrane losowo. Skrawki barwiono hematoksyliną i eozyną i następnie przykrywano drugim szkiełkiem. Każdy preparat badano w powiększeniu 1000x z olejkiem immersyjnym. Dla każdego łożyska oceniono 50 pól (10 pól widzenia z każdego preparatu). Liczbę zidentyfikowanych jąder apoptotycznych wyrażano jako odsetek całkowitej liczby wszystkich zliczonych jąder komórkowych. Średnio zliczano 5000-7000 jąder dla każdego badanego łożyska. W doświadczeniach pilotażowych błąd obserwacji prowadzonych przez różnych badaczy wynosił 17%, ale uszeregowanie preparatów przez badaczy (od najwyższego do najniższego odsetka jąder apoptotycznych) było bardzo podobne. Wszystkie wyliczenia i odsetki podawane tutaj zostały uzyskane przez jednego badacza po to, aby uniknąć błędu obserwacji między różnymi badaczami. Badacz nie miał danych na temat preparatów a błąd obserwacji dla tego jednego badacza wynosił 2%. W celu zbadania, czy istnieje jakieś zróżnicowanie w częstości występowania apoptozy w różnych częściach tego samego łożyska, pięć łożysk spośród łożysk z trzeciego trymestru ciąży podzielono na 3 warstwy: zewnętrzną, środkową i wewnętrzną. Następnie z każdej z tych warstw pobrano losowo próbki.

Ocena w mikroskopie elektronowym

Wycinki łożysk utrwalano techniką stosowaną w mikroskopii elektronowej. Przeprowadzono badania siedmiu oddzielnych próbek z łożyska. Każdy preparat badano wielokrotnie. Po utrwaleniu krojono skrawki tkanek, umieszczano na szkiełku i barwiono przy pomocy błękitu toluidyny. Komórki apoptotyczne w tych skrawkach najpierw identyfikowano pod mikroskopem świetlnym; następnie wynik potwierdzano przy pomocy mikroskopu elektronowego. W tym celu z tego samego fragmentu krojono kilka skrawków i przygotowywano preparat solami ołowiu.

Ocena TUNEL za pomocą metody preparatów barwionych

Przeprowadzono je w 21 próbkach łożyska, które utrwalono w 10% formalinie. Technika TUNEL (TUNEL Terminal deoxynucleotidyl transferaze mediated dUTP-marker Nick-End Labelling) znakowanie uciętych końców markerem dUTP za pośrednictwem terminalnej transferazy dezoksynukleotydylowej po raz pierwszy została opisana przez zespół Gavrielli i wsp. w 1992 roku.¹⁴ Zwrot nick-end(=ucięte końce) odnosi si Zwrot do grup 3’-OH DNA, które powstają w wyniku działania endonukleazy w obszarach DNA zawierających połączenia między nukleosomami. Fragmentacja DNA jest charakterystyczną cechą apoptozy.¹⁵ W zastosowanym systemie wykrywania markerem dołązastosowanym systemie dUTP była digoksygenina. Enzym terminalna transferaza dezoksynukleotydylowa (TdT) tworzył polimerowy ogon na uciętych koń“uciętych” końcach 3’-OH DNA dUTP-digoksygeniną. Po znakowaniu układ przeciwciało przeciwko digoksygeninie-peroksydaza był dołączany do cząsteczki digoksygeniny na ogonie markera. Na koniec dołączano diaminobenzydynę (DAB) znacznik wią (DAB) – znacznik digoksygeniny i wtedy z takiego chromogenicznego substratu powstawał intensywny brązowy sygnał. Tkankę następnie barwiono ponownie zielenią metylową lub hematoksyliną i preparaty badano w mikroskopie świetlnym w powiększeniu 1000x (tak samo jak opisane wcześniej). Zabarwione na brązowo komórki/ jądra apoptotyczne były łatwo dostrzegalne, w odróżnieniu od innych komórek/jąder, które były zielone lub niebieskie (ApopTagŇ Plus In-Situ Apoptosis Detection Kit Peroxidase, Oncor Inc.). Znakowanie techniką TUNEL stosowano g Plusównie w celu identyfikacji/ potwierdzenia apoptozy w komórkach łożyska. W czterech przypadkach technikę TUNEL wykorzystano do ilościowej oceny apoptozy.

WYNIKI

Wykazanie apoptozy

Przy pomocy mikroskopu świetlnego wykazano występowanie apoptozy w komórkach pochodzących z próbek łożyska z całego okresu ciąży (ryc. 4).

Apoptozę stwierdzono we wszystkich typach komórek w tkankach łożyska. Wykazanie obecności komórek apoptotycznych potwierdzono następnie w mikroskopie elektronowym transmisyjnym (ryc. 5). Występowanie apoptozy potwierdzono również stosując technikę barwienia TUNEL (ryc. 6).

Ocena ilościowa apoptozy

Częstość występowania komórek/jąder apoptotycznych w próbkach łożyska z trzech trymestrów ciąży oceniana przy pomocy mikroskopu świetlnego, została przedstawiona na rycinie 7. Częstość występowania apoptozy w I i II trymestrze ciąży była podobna. Częstość występowania apoptozy była istotnie wyższa w trzecim trymestrze niż w trymestrze pierwszym i drugim (p<0,01, U test Mann-Whitney) oraz istotnie wyższa w łożyskach z III trymestru ciąż powikłanych IUGR niż w łożyskach z ciąż prawidłowych. Odsetki komórek/jąder apoptotycznych w stosunku do całkowitej liczby komórek w każdym przedziale komórkowym (dla wszystkich grup) były następujące: komórki nabłonka 6%, komórki podścieliska 31% i komórki/trofoblastu 63%. Większość apoptotycznych jąder trofoblastu stwierdzono w syncytiotrofoblaście.

Ryc. 4. Obraz w mikroskopie świetlnym jąder apoptotycznych w guzkach syncytium (syncytiotrofoblast). Łożysko w ciąży donoszonej. Jądra apoptotyczne są łatwe do rozpoznania. Niektóre jądra mają równomierną gęstość podczas gdy inne wykazują brzeżne ułożenie chromatyny jądrowej. Barwienie błękitem toluidyny, powiększenie 1000x z olejkiem immersyjnym.

Nie znaleziono istotnych różnic w częstości występowania apoptozy w różnych obszarach tego samego łożyska (tabela 1).

Cięciem cesarskim zakończono znacznie więcej ciąż powikłanych IUGR niż ciąż prawidłowych. Analiza wyników badań grupy kontrolnej obejmującej łożyska z III trymestru prawidłowych ciąż nie wykazała istotnych różnic w częstości występowania apoptozy między grupą kobiet, które rodziły drogami natury, a grupą rozwiązanych cięciem cesarskim.

Porównano wyniki dla czterech popłodów, ocenianych ilościowo w mikroskopie świetlnym i w badaniu z techniką TUNEL. Wykazano, że częstość występowania apoptozy oceniana z zastosowaniem techniki TUNEL była prawie dwa razy większa niż częstość określona na podstawie obliczeń przy pomocy konwencjonalnej techniki z użyciem mikroskopu świetlnego (tabela 2).

DYSKUSJA

Występowanie apoptozy w komórkach łożyska zostało jednoznacznie udowodnione. Wykazano, że częstość występowania apoptozy jest znamiennie wyższa w trzecim trymestrze ciąży niż w trymestrze pierwszym i drugim. Całkowita częstość występowania apoptozy okazała się znamiennie wyższa w komórkach łożysk pochodzących z ciąż powikłanych IUGR niż w komórkach łożysk pochodzących z prawidłowych niepowikłanych ciąż. Pomyślnie zrealizowano wszystkie trzy główne założenia projektu Nottingham i praca została przyjęta do publikacji.^16,17 Interpretując uzyskane wyniki należy uwzględnić kilka kwestii.

Choć doniesienia na temat apoptozy w łożysku ukazują się od niedawna, jej występowanie wykazało kilka niezależnych grup badawczych.^5,6,18,19,20 Panuje pogląd, że apoptoza odgrywa ważną rolę w fizjologii i patofizjologii łożyska. Nasze badanie wykazało występowanie apoptozy przez cały okres ciąży w trofoblaście, komórkach nabłonka i komórkach podścieliska. Potwierdza to rolę apoptozy jako naturalnego zjawiska biologicznego.³ Apoptoza musi występować we wszystkich tkankach i we wszystkich typach komórek. Informacje dostępne w literaturze na temat częstości występowania apoptozy w innych tkankach są ubogie, jednak jej występowanie w kłębuszkach nerkowych zdrowych szczurów oceniano na 0,01% komórek.²¹ Częstość występowania apoptozy, jaką wykazano tutaj, jest zgodna z tym niskim wskaźnikiem podstawowym.

Ryc. 5. Obraz w transmisyjnym mikroskopie elektronowym jąder apoptotycznych w syncytiotrofoblaście. Łożysko w ciąży donoszonej. Charakterystyczne zmiany w jądrach są łatwe do rozpoznania. Skala 2 mm powiększenie 8500x

Spostrzeżenie, że częstość występowania apoptozy w łożysku jest istotnie większa w trzecim trymestrze ciąży w porównaniu do pierwszego i drugiego trymestru, pozostaje w zgodzie z doniesieniem zespołu Kim i wsp.²⁰ na temat zmniejszenia ekspresji bcl-2 w tkance łożyska w trzecim trymestrze. Główna rola bcl-2 polega na hamowaniu apoptozy a zmniejszenie ekspresji bcl-2 w trzecim trymestrze pozostawałoby w zgodzie z naszymi wynikami histologicznymi wskazującymi na nasilenie apoptozy. Fakt, że częstość występowania apoptozy zwiększa się w miarę rozwoju ciąży, nie jest zaskakujący w świetle sugestii, że apoptoza może odgrywać pewną rolę w procesie starzenia. Tkanki mogą z wiekiem stawać się bardziej wrażliwe na bodźce apoptotyczne.⁸

Ryc. 6. Obraz w mikroskopie świetlnym apoptotycznych jąder znakowanych techniką TUNEL. Tkanka łożyska z pierwszego trymestru ciąży. Apoptotyczne jądra są zabarwione na brązowo. Barwienie tła zielenią metylową, powiększenie 1000x – olejek

Ryc. 7. Wykres przedstawiający częstość występowania apoptozy w badanych grupach. Ocena ilościowa została przeprowadzona przy pomocy mikroskopu świetlnego (patrz: metody). Dla każdego zbadanego łożyska częstość występowania komórek apoptotycznych to całkowita liczba zidentyfikowanych komórek apoptotycznych (wszystkich rodzajów) wyrażona jako odsetek całkowitej liczby komórek zliczonych w próbce. Statystyka: podane wartości to wartości mediany i zakresy interkwartyli

Jedno z oczywistych pytań, jakie nasuwa się w tym badaniu brzmi: czy obserwowany wzrost częstości występowania apoptozy w przypadkach IUGR jest wynikiem patologicznych procesów prowadzących do IUGR czy jego etiologicznym komponentem. Jednym ze znanych czynników wyzwalających apoptozę jest hipoksja⁸ gdyby powstawanie łożyska odbywało si – w miejscu o stosunkowo słabym przepływie krwi, to apoptoza mogłaby odpowiadać za IUGR. Jednak nasilenie apoptozy komórek łożyska obserwowane w takiej sytuacji można interpretować jako efekt nieprawidłowego rozwoju łożyska i IUGR a nie zjawisko etiologiczne. Wzrost oporu naczyń płodowo-łożyskowych na poziomie kapilarnym, upośledzający wymianę gazów i substancji odżywczych, mógłby być przyczyną apoptozy komórek łożyska. Gdyby tak było, to apoptoza w takich warunkach pojawiałaby się jako wynik patologicznych procesów prowadzących do IUGR. Nelsons⁶ zasugerował, że obszary apoptozy w syncytiotrofoblaście mogą być elementem fizjologicznego procesu prowadzącego do ułatwienia transportu przez łożysko. Gdyby powstawanie łożyska odbywało się w obszarach o stosunkowo słabym przepływie krwi, powodującym niedokrwienie łożyska, wówczas można by zwiększoną apoptozę w takich warunkach interpretować jako próbę kompensacji tego względnego niedokrwienia i zwiększenia wymiany łożyskowej. Możliwe jest także, że w niektórych przypadkach nasza wstępna hipoteza jest prawdziwa i że wzrost apoptozy komórek łożyska jest pierwotnym procesem patologicznym, którego konsekwencją jest mniejsze łożysko i tym samym mniejsze dziecko. Jeśli tak jest, to na szczególną uwagę zasługuje dokładne zbadanie czynników prowadzących w takiej sytuacji do apoptozy.

Komórki apoptotyczne pomimo swojej charakterystycznej morfologii są trudne do zidentyfikowania. Liczenie komórek objętych apoptozą to metoda subiektywna i wymagająca powtarzania, a poza tym otwiera duże możliwości indywidualnej interpretacji. Wszystkie prezentowane wyniki oceny ilościowej były owocem pracy jednej osoby po to, aby uniknąć błędu obserwacji pomiędzy kilkoma badaczami. Kontrola wyników uzyskanych w mikroskopii świetlnej przy użyciu mikroskopu elektronowego (i innych technik mikroskopowych) miała jednak ważne znaczenie. Mikroskopia elektronowa pozostaje jedynym wiarygodnym narzędziem identyfikacji komórek dotkniętych apoptozą.⁷ Niestety, ze względu na rzadkość występowania apoptozy w tkankach łożyska (podobnie jak w innych materiałach ex vivo), ocena ilościowa apoptozy w łożysku przy pomocy tej metody byłaby zbyt kosztowna.

Jak przedstawiono w rozdziale prezentującym wyniki, częstość występowania apoptozy określona z użyciem metody TUNEL była 2-krotnie wyższa niż wartość określona przy użyciu samego mikroskopu świetlnego. Szereg najnowszych prac zawiera doniesienia o tym, że metodą TUNEL znakowane są także komórki martwicze (Gold i wsp.²² i Yasuda i wsp.²³), co częściowo mogłoby tłumaczyć powyższe rozbieżności. Poza tym zestawy do znakowania TUNEL mogą identyfikować komórki apoptotyczne przez znakowanie ich uciętych końrkiów zanim ich morfologiczne cechy staną siw” widoczne. Te dwie możliwości należy brać po uwagę starając się wytłumaczyć obserwowane rozbieżności.

Syncytiotrofoblast jest jedyną w swoim rodzaju, fascynującą tkanką, składającą się ze zbioru jąder w morzu cytoplazmy. Bardzo mał“morzu” cytoplazmy. Bardzo temat apoptozy w tkankach wielojądrzastych. Schwartz i jego współpracownicy opublikowali wiele prac badających śmierć komórki w mięśniach międzysegmentowych (ISMs – Intersegmental Muscles) zmierzchnicy Manduca sexta, które są przykładem tkanki wielojądrzastej. Komórki tej tkanki przechodzą pewną formę programowanej śmierci komórki, którą Schwartz odróżnia od apoptozy^24,25 i którą określa pojęciem nie-apoptotycznej programowanej ściem “nie-apoptotycznej”órki. W badaniu ultrastrukturalnym te umierające komórki nie wykazują obecności pęcherzyków pod błoną komórkową ani brzeżnego odkładania chromatyny. DNA z komórek pochodzących z ISM Manduca sexta które przeszły taką nieapoptotyczną programowaną śmierć komórki nie wykazuje rozszczepienia na fragmenty nukleosomalne, co sugeruje że nie ujawnia się tu aktywność endonukleazy. W czasie tej programowanej śmierci komórki jądra komórkowe tracą swoją wielopłatową postać, stają się małe i nabierają okrągłego kształtu. Chromatyna staje się pyknotyczna, ale nie układa się wzdłuż wewnętrznej warstwy otoczki jądra; przeciwnie tworzy ogniskowe skupienia rozrzucone w całym jądrze. Takie zmiany jądra komórkowego nie mogą być klasyfikowane jako apoptotyczne według kryteriów Kerr i wsp.² Obrazy apoptotycznych ją Obrazy “apoptotycznych” syncytiotrofoblastu łożyska uzyskane w transmisyjnym mikroskopie elektronowym wykazały, że niektóre jądra mają klasyczny wygląd apoptotyczny a niektóre umierające jądra mają cechy podobne do tych opisywanych przez Schwartza i wsp. w ISM u Manduca sexta. To nasuwa nam na myśl, że być może stwierdzamy pewien wariant programowanej śmierci komórki podobny do przypadku opisywanego przez Schwartza. Podczas gdy wyniki badań w mikroskopie elektronowym częściowo popierałyby taką konkluzję to fakt, że mieliśmy pozytywne wyniki znakowania metodą TUNEL w tkankach łożyska bardziej przemawia za klasyczną apoptozą. W apoptozie komórki są usuwane z tkanek w procesie fagocytozy albo przez wyspecjalizowane fagocyty, takie jak makrofagi, albo przez komórki śródmiąższowe, które stają się oportunistycznymi fagocytami. W istocie apoptotyczne komórki lub fragmenty apoptotyczne oglądane w mikroskopie elektronowym są zwykle obecne wewnątrz komórek fagocytarnych. Syncytiotrofoblast nie jest utworzony przez oddzielne pojedyncze komórki, tak więc nie ma warunków dla fagocytozy. Pomimo tego faktu wykazano w badaniu mikroskopem elektronowym charakterystyczne cechy jąder apoptotycznych w syncytiotrofoblaście. Możliwe, że te apoptotyczne jądra złuszczają się do krążenia matczynego, gdzie następnie są fagocytowane.

Jak wspomniano w części przedstawiającej wyniki, większość przypadków apoptozy w tkankach łożyska obserwowano albo w warstwie trofoblastu albo w podścielisku kosmków. Nie budzi to specjalnego zdziwienia, ponieważ w łożysku z 12.-16. tygodnia stwierdza się następujące proporcje jeśli chodzi o jądra komórkowe: 39%- trofoblast, 50%-podścielisko i 11%-śródbłonek; w ciąży donoszonej te wartości wynoszą odpowiednio: 40%, 47% i 13%.²⁶ W czasie całej ciąży jąder syncytiotrofoblastu jest zatem więcej niż jąder cytotrofoblastu, ich stosunek wynosi 9:1,²⁷ a apoptoza w warstwie zespólni pomaga zachować ten stosunek. Apoptoza jest rzadkim zjawiskiem, należałoby więc oczekiwać, że łatwiej będzie ją można stwierdzić w najbardziej rozpowszechnionych rodzajach komórek/jąder w danej tkance. Niski poziom apoptozy stwierdzony w komórkach śródbłonka mógłby również wynikać z szybkiego złuszczania się tych komórek do krążenia płodowego gdy tylko dojdzie w nich do apoptozy. Częstsze występowanie apoptozy w łożyskach pochodzących z ciąż powikłanych IUGR okazuje się być wynikiem zwiększonej apoptozy wewnątrz syncytiotrofoblastu. Dopóki jednak nie określimy ilościowo tego procesu w trofoblaście nie można wykluczyć, że ulegamy jedynie pewnemu wrażeniu. Apoptozę obserwowano we wszystkich rodzajach komórek w tkankach łożyska, zarówno w łożyskach pochodzących z prawidłowych ciąż jak i tych powikłanych IUGR. Niewykluczone, że natężenie apoptozy wzrasta do podobnego poziomu we wszystkich rodzajach komórek tworzących łożysko.

Obecnie w Nottingham trwają prace nad kilkoma modelami in-vitro apoptozy łożyskowej mające na celu wyjaśnienie niektórych jej mechanizmów. Guilbert i wsp. ustalili już, że apoptozę w hodowli komórek ludzkiego trofoblastu może indukować połączenie TNF-a z ludzkim interferonem-g.²⁸ Wykazali również, że ten efekt jest odwracalny pod wpływem naskórkowego czynnika wzrostu.²⁹ Rola IGF-1 wymaga dalszych badań, gdyż wiadomo że czynnik ten zmniejsza obumieranie komórek w hodowlach komórkowych.³⁰ Doniesienie o obniżonych poziomach IGF-1 u kobiet będących w ciąży powikłanej IUGR jest spójne z hipotezą, że apoptoza w łożysku wzrasta w przypadku IUGR.³¹ Działanie płytkowego czynnika wzrostu (PDGF – platelet derived growth factor) naczyniowo-śródbłonkowego czynnika wzrostu (VEGF – vascular endothelial growth factor)ównież wymaga badań. Sugeruje się, że mają one podstawowe znaczenie w patogenezie IUGR.³²

Podziękowania

Autorzy pragną podziękować Emlyn Price i Trevor Gray za pomoc techniczną w czasie badania.

powrót do spisu treści

powrót do listy numerów archiwalnych

powrót do strony głównej

Piśmiennictwo

1. Majno G, Joris I. Cells, tissues, and disease. Principles of general pathology. Cambridge: Blackwell Science 1996

2. Kerr JFR, Wylie AH, Currie AR. Apoptosis: A basic biological phenomenon with wide-ranging implications in tissue kinetics. Br J Cancer 1972; 26; 239-257

3. Kerr JFR. A histochemical study of hypertrophy and ischaemic injury of rat liver with special reference to changes in lysosomes. J Pathol Bact 1965; 90; 419-435.

4. Harmon BV, Allan DJ. Apoptosis: a 20^th Century Scientific Revolution. In: Sluyser M (ed.) Apoptosis in normal development and cancer. London: Taylor & Francis, 1996: 1-19

5. Price E, Smith S.C., Symonds EM, Baker PN. Placental apoptosis in pre-eclampsia and intrauterine growth retardation. Hyper in Preg, 1997; 16(2): 290

6. Savill J. Apoptosis in disease. Eur J Clin Invest 1994; 24: 715-723

7. Wylie AH, Duvall E. Cell injury and death. In: McGee JO’D, Isaacson PG, Wright NA (eds) Oxford textbook of pathology, principles of pathology. Oxford: Oxford Univerity Press, 1992; 1: 141-147

8. Tanuma S-I. Molecular mechanisms of apoptosis. In: Sluyser M (ed.) Apoptosis in normal development and cancer. London: Taylor & Francis. 1996: 39-59

9. Nelson DM Apoptotic changes occur in syncytiotrophoblast of human placental villi where fibrinoid is deposited at discontinuities in the villous trophoblast. Placenta 1996; 17: 387-391

10. Wilcox MA, Johnson IR, Maynard PV, Smith SJ, Chilvers CED. The individualised birthweight ratio: a more logical outcome measure of pregnancy than birthweight alone. Br J Obstet Gynaecol 1993; 100: 342-347

11. Baker PN, Johnson IR, Gowland PA, Hykin J, Adams V, Mansfield P, Worthington BS. Measurement of fetal liver, brain and placental volumes with echo-planar magnetic resonance imaging. Br J Obstet Gynaecol 1995; 102: 35-39

12. Teasdale F. Idiopathic intrauterine growth retardation: histomorphometry of the human placenta. Placenta 1984; 5: 83-92

13. Shen Y. Stereological study of the placenta in intrauterine growth retardation with different ponderal index. Chinese J Obstet Gynecol 1992, 27: 351-354

14. Gavrieli Y, Sherman Y, Ben-Sasson S.A. Identification of programmed cell death in situ via specific labelling of nuclear DNA fragmentation. J Cell Biol 1992; 119(3): 493-501

15. Arends MJ i wsp. Apoptosis: the role of the endonuclease. Amer J Pathol 1990; 136: 593-608

powrót do spisu treści

powrót do listy numerów archiwalnych

powrót do strony głównej