powrót do spisu treści

powrót do listy numerów archiwalnych

powrót do strony głównej

Minisympozjum: genetyka molekularna w położnictwie i ginekologii

Kliniczne możliwości terapii genowej

M. Connor, Institute of Medical Genetics, School ofCIinical Medicine, Yorkhill, Glasgow, UK.. Tłumaczyła Lidia Martyńska

Dzięki postępowi w izolowaniu ludzkich genów oraz w wyjaśnianiu ich normalnej oraz patologicznej czynności - terapia genowa stała się rzeczywistością kliniczną. Pierwsze takie leczenie(suplementacja genu w niedoborze dezaminazy adenozyny) zastosowano w 1990 r., a późniejsze liczne doniesienia o stosowaniu terapii genowej wykazały jej znaczenie regulacyjne. Początkowo terapia genowa obejmowała dwa kierunki działań: suplementację w chorobach jednogenowych oraz procedury terapeutyczne w onkologii. W grupie chorób jednogenowych zainteresowania były zogniskowane wokół takich chorób, jak: niedobór dezaminazy adenozyny, mukowiscydoza, hipercholesterolemia rodzinna i hemofilia B.

W onkologii poszukiwano zastosowania terapii genowej do wykrywania markerów nowotworowych, pozwalających ocenić skuteczność zastosowanego leczenia, do niszczenia komórki nowotworowej (poprzez stymulację układu immunologicznego albo przez celowane wiązanie leków z komórkami nowotworowymi) oraz w strategii antysensownej. Dużo szersze zastosowania może mieć terapia genowa polegająca na podawaniu egzogennych genów i modyfikacji czynności genów endogennych. Terapia ta może znaleźć zastosowanie w leczeniu chorób układu sercowo-naczyniowego, chorób neurologicznych, a także w eliminacji zakażenia HIV. Biorąc pod uwagę fakt, że dopiero teraz klonuje się ludzkie geny i określa się ich funkcję, lista potencjalnych możliwości zastosowania terapii genowej wzrasta. Dobre rezultaty osiągane w pierwszych próbach leczenia wskazują dalszy kierunek rozwoju tej metody, ale wymaga ona jeszcze wielu obserwacji i potwierdzenia tych początkowych, entuzjastycznie optymistycznych spostrzeżeń.

Terapia genowa, obejmująca podawanie egzogennych genów i modyfikowanie aktywności genów endogennych, w ciągu ostatnich kilku lat stała się rzeczywistością. Doprowadził do tego postęp w klonowaniu genów i w wyjaśnianiu złożonych mechanizmów regulowania i funkcjonowania ich czynności. Daje to szansę wdrożenia nowych sposobów leczenia różnych stanów chorobowych i chociaż początkowo skupiono się na rzadkich chorobach genetycznych, szybko zostały podjęte prace nad terapią genową nowotworów, a w przyszłości możliwe jest jej zastosowanie w leczeniu powszechnych chorób sercowo naczyniowych i neurologicznych. Artykuł ten jest przeznaczony dla lekarzy, którzy chcą rozpoznawać choroby genetyczne, odpowiednio kwalifikować pacjentów i udzielać im porad. Jest on ogólnym przeglądem dotychczasowego postępu terapii genowej oraz trudności, które jeszcze trzeba pokonać. Nie jest to opracowanie naukowe dotyczące biologii molekularnej, patofizjologii różnych podtypów chorób genetycznych, szczegółowych zasad terapii genowej, rozwoju zastosowań klinicznych w chorobach jednogenowych, nowotworach, czy też innych stanach chorobowych, nie jest to też opracowanie ukierunkowane na przedstawienie złożonych problemów etycznych. Ostatnio rocznie ukazuje się ponad 300 publikacji na ten temat, stąd w pracy wymienione są tylko podstawowe artykuły poglądowe, które dla czytelnika mogą być źródłem umożliwiającym, w razie potrzeby, dotarcie do oryginalnych opracowań szczegółowych.

Normalna regulacja aktywności genu^{1, 2}

Pierwszy ludzki gen (laktogen łożyskowy - HPL, somatomammotropina kosmówkowa - HCS) został sklonowany w 1977 r. Do dnia dzisiejszego, w całości lub częściowo, wyizolowano ponad 25 000 genów kodujących (co szacunkowo stanowi około 25% całości). Niektóre z tych genów (około 20%) ulegają ekspresji w komórkach wielu różnych tkanek. Są one określane jako „house-keeping genes", czyli geny niezbędne do utrzymania metabolizmu komórkowego, jako że odpowiadają za ogólne, podstawowe funkcje życiowe komórki. Szacuje się, że niezależnie od rodzaju komórki, stanowią one ponad 90% wszystkich, ulegających ekspresji genów. Pozostałe geny są aktywowane albo tylko w określonym czasie, albo tylko w wyspecjalizowanych komórkach. Tak więc, chociaż każda komórka posiadająca jądro ma taki sam potencjał genetyczny, to rozkład ekspresji genów w poszczególnych komórkach jest jednak znacznie zróżnicowany. Na przykład geny hemoglobiny ulegają ekspresji tylko w prekursorach krwinek czerwonych, a poziom ich aktywności jest precyzyjnie regulowany, w celu zachowania równowagi pomiędzy syntezą łańcuchów alfa i beta, których połączenie tworzy hemoglobinę. Tak więc mechanizmy kontrolujące nie tylko determinują, które geny są aktywne, ale także, zależnie od chwilowego zapotrzebowania, regulują tę aktywność. W proces ten zaangażowane są regiony sąsiadujące z genem ulegającym ekspresji. Podlegają one skomplikowanemu, niecałkowicie jeszcze zrozumiałemu, wzajemnemu oddziaływaniu licznych ogólnych i specyficznych czynników transkrypcyjnych, co determinuje poziom aktywności danego genu.

W żywych komórkach wiele genów równocześnie produkuje matrycowy RNA (mRNA), który przechodzi do cytoplazmy i jest odkodowywany w procesie translacji do białka, które może być wykorzystane w komórce lub transportowane w inne miejsce. Produkowane białka mogą pełnić funkcję enzymów w szlakach metabolicznych, spełniać rolę strukturalną (np. elastyna czy kolagen), albo działać jako cząsteczki nośnikowe (np. hemoglobina, albumina). Aktywność genowa w pojedynczej komórce zmienia się bardzo szybko, ale przeciętna jej wartość jest dość stała i podobna w różnych komórkach danego typu. Aktywność genowa charakteryzuje zatem stan czynnościowy komórki, np. stopień jej zróżnicowania. Modyfikacja ekspresji genów potencjalnie może zmienić albo pojedynczą funkcję, np. ektopiczną produkcję białka nie będącego białkiem „housekeeping", albo też modyfikować jego syntezę i potencjalną czynność, np. naprawę wyspecjalizowanych tkanek przez nie wyspecjalizowane komórki prekursorowe.

Patofizjologia chorób genetycznych³

Wyróżnia się cztery główne podgrupy chorób genetycznych (tab. 1). Zaburzenia chromosomalne, najbardziej jednoznaczne, obserwowane pod mikroskopem świetlnym nieprawidłowości struktury chromosomów, są najlepiej poznanym, ale obecnie najrzadziej występującym typem chorób genetycznych. Chorzy wykazują brak równowagi w aktywności wielu genów z - odpowiednio - jej redukcją (dla delecji), albo wzrostem (dla duplikacji). Nieznany jest jeszcze mechanizm, w jakim taki brak równowagi prowadzi do wystąpienia poszczególnych objawów klinicznych. W związku z tym terapia genowa udoskonalająca albo korygująca choroby chromosomalne obecnie jest jeszcze odległą perspektywą.

Choroby pojedynczych genów powstają w wyniku mutacji jednego albo w obydwu allelach pary genów autosomalnych w chromosomach somatycznych, autosomach lub w chromosomie płciowym. Stanowią one dużą podgrupę ponad 6000 już znanych schorzeń oraz znacznie większej liczby chorób prawdopodobnie uwarunkowanych genetycznie. Ich częstotliwość przekracza częstość występowania chorób chromosomalnych. Recesywne autosomalne choroby jednogenowe to zwykle zaburzenia genów odpowiedzialnych za syntezę białek enzymatycznych. Często komórki mogą zupełnie dobrze funkcjonować przy bardzo niskim poziomie aktywności wytwarzanego białka enzymatycznego. W chorobach autosomalnych dziedziczonych recesywnie chory ma dwie kopie zmutowanych genów, których aktywność obniżona jest do zera, podczas gdy jego zdrowi rodzice - z jedną kopią normalną i jedną nieaktywną - posiadali 50% normalnej aktywności enzymatycznej. Zazwyczaj 10-procentowa lub niewiele wyższa aktywność genetyczna wystarcza do zachowania prawidłowej aktywności szlaków metabolicznych komórki. Daje to duży margines bezpieczeństwa i pacjenci będący heterozygotami mogą być poddani terapii genowej. Dla kilku chorób autosomalnych recesywnych, (np. dla fenyloketonurii), blok metaboliczny można obejść poprzez modyfikację diety, a w kilku innych, (np. w chorobie Gauchera typu dorosłego), możliwe jest oczyszczenie i zastąpienie nieprawidłowego enzymu. W odniesieniu do większości recesywnych chorób autosomalnych leczenie zmodyfikowaną dietą albo zastąpienie enzymu nie jest możliwe lub nie daje pełnego efektu. Choroby te można zakwalifikować do terapii genowej, polegającej na podawaniu do komórek tkanki docelowej dodatkowej prawidłowej kopii zmienionego genu (uzupełniająca terapia genowa).

W przeciwieństwie do przedstawionej grupy chorób, dominujące choroby autosomalne są zazwyczaj związane z produkcją białek strukturalnych albo nośnikowych, a nie enzymatycznych. Kiedy zmutowane geny kodują syntezę enzymów (np. w ostrej napadowej porfirii), albo syntezę białek receptorowych (np. gdy występuje niska gęstość receptorów lipoproteinowych w rodzinnej hipercholesterolemii), obniżenie o 50% aktywności enzymatycznej lub ilości receptorów przekracza margines bezpieczeństwa i wywołuje objawy choroby.

Występowanie objawów chorobowych u osobnika z jednym genem zmutowanym, a drugim prawidłowym (heterozygota) jest charakterystyczne dla dziedziczenia dominującego. W takiej sytuacji uzupełnianie ilości prawidłowego genu w komórkach docelowych jest celowe i jest już stosowane w rodzinnej hipercholesterolemii. W niektórych postaciach chorób autosomalnych dominujących ustalenie patogenezy choroby i zastosowanie terapii genowej nie jest łatwe. Często produkt ekspresji genu współdziała z innymi białkami albo innymi genami w celu uzyskania ostatecznej struktury białka. Na przykład, typ l kolagenu jest trimerem dwu podjednostek łańcuchów polipeptydowych alfa 1 i jednej podjednostki alfa 2, których synteza jest wynikiem ekspresji oddzielnych par genów.Mutacje w jednym genie produkującym podjednostkę alfa 2 powoduje, że 50% kolagenu typupierwszego jest nieprawidłowe, zaś mutacja genu produkującego podjednostkę alfa 1 daje nieprawidłowość 75% kolagenu. Z tego względu mutacja pojedynczego genu może mieć nieproporcjonalnie duże znaczenie (nazywane samobójstwem białka) i dalsze dodawanie prawidłowego genu może nie rozwiązywać problemu. Naprawa genów poprzez wywołanie mutacji w określonym miejscu możliwa jest technicznie in vitro, ale postępowanie takie in vivo nie jest jeszcze obecnie osiągalne. Dlatego wydaje się mało prawdopodobne, aby w najbliższym czasie choroby te kwalifikowały się do terapii genowej.

Geny zawarte w chromosomach płciowych mogą kodować albo enzymy (np. czynniki krzepnięcia w hemofilii A i B), albo białka strukturalne (np. dystrofina, której niedobór powoduje dystrofię mięśniową Duchenne'a). Tam, gdzie aktywność enzymatyczna ma duży margines bezpieczeństwa (np. u pacjentów z ciężką postacią hemofilii, u których aktywność czynnika krzepnięcia wynosi mniej niż 5%), można próbować uzupełniającej terapii genowej, ale w przypadkach, w których wymagana jest naprawa genu albo funkcja genu nie jest jeszcze poznana (np. w zespole łamliwego chromosomu X), zastosowanie terapii genowej w najbliższym czasie jest mało prawdopodobne.

Choroby częściowo uwarunkowane genetycznie są powszechne i obejmują liczne wrodzone wady rozwojowe, a także pospolite przewlekłe choroby występujące u osób dorosłych (np. nadciśnienie, zapalenie stawów, demencja). W przeciwieństwie do chorób jednogenowych, o których była mowa wcześniej, w chorobach częściowo uwarunkowanych genetycznie dziedziczenie nie jest jednoznaczne i jest one identyfikowane jako wzrost ryzyka wystąpienia choroby u członków rodziny, w stosunku do prawdopodobieństwa obciążenia genetycznego. Geny działają pojedynczo albo w kombinacji, powodując zwiększenie podatności człowieka na wpływ czynników środowiskowych i dlatego można zapobiegać wystąpieniu choroby albo przez ograniczanie wpływu środowiska, albo przez modyfikowanie wrażliwości genetycznej.

Obecnie liczba i struktura genów, które są zaangażowane w większość chorób częściowo uwarunkowanych genetycznie, jest jeszcze w większości nieznana i równie mało znane są ich interakcje ze środowiskiem. W związku z tym, terapia genowa zapobiegająca chorobom częściowo uwarunkowanym genetycznie na razie nie jest realna, ale rozważane jest postępowanie mogące mieć wpływ na rozwój tych chorób.

Powszechnie występują także kumulacyjne choroby genetyczne; do grupy tej zalicza się np. wszystkie nowotwory. Nowotwory powstają z pojedynczych komórek, które wyzwoliły się spod normalnych mechanizmów regulacyjnych. Te mechanizmy kontrolne zależne są od aktywności wielu genów. Aby doszło do rozwoju nowotworu, zwykle muszą być inaktywowane liczne pary genów supresorowych transformacji nowotworowej. Pierwsza mutacja inaktywacyjna może być odziedziczona; zjawisko to wiąże się z rodzinną skłonnością do wczesnego powstawania nowotworów i tendencją do występowania licznych nowotworów u osób chorych (np. dziedziczny rak piersi i jajnika spowodowane są mutacjami BRCA1). W procesie onkogenezy, poza utratą funkcji licznych genów supresorowych, dodatkowo, również powszechnie, występuje aktywacja mutacji w onkogenach. Dokładny wzór inaktywacja/aktywacja może być różny u pacjentów z takim samym nowotworem i różni się dla różnych typów nowotworów.

Stanowi to przyczynę różnic w reakcji na standardowe metody leczenia i w rokowaniu co do wyleczenia. Najprostszym zastosowaniem terapii genowej w takich sytuacjach byłoby uzupełnienie prawidłowej kopii kluczowego genu supresorowego dla nowotworów. Postępowanie to jest jednak ograniczone przez trudności w docelowym dostarczaniu genu do każdej atypowej komórki, ale istnieje różnorodność możliwych do zastosowania rozwiązań. Przedstawiono je w dalszej części artykułu.

Podstawowe zasady terapii genowej^4-6

Aktualne podejście do terapii genowej można ogólnie rozważać jako dodawanie genów egzogennych oraz manipulację funkcjonowaniem genów endogennych. Aby egzogenny gen mógł być przenoszony i ulegał ekspresji, muszą być spełnione dwa podstawowe warunki:

1. Gen i sąsiadujące z nim obszary regulacyjne muszą być sklonowane i musi być znana ich charakterystyka.

2. Gen musi być przeniesiony do komórek tkanki docelowej i tam właściwie funkcjonować.

Jak wspomniano wcześniej, dokonał się gwałtowny rozwój klonowania ludzkich genów, chociaż postęp w zrozumieniu ich mechanizmów regulacyjnych jest wolniejszy. Geny w znacznym stopniu różnią się wielkością, niektóre, takie jak globiny (złożone z 1500 par zasad) są maleńkie, podczas gdy inne, jak dystrofina składająca się z 2 400 000 par zasad, są olbrzymie. Wiele ze sposobów przenoszenia genów nadaje się tylko do odpowiednio małych genów, zaś do przeniesienia większych genów ważne jest określenie obszarów istotnych z czynnościowego punktu widzenia.

Opracowano liczne metody przenoszenia genów (tab.2). W początkowym okresie eksperymentów szeroko stosowane były wektory retrowirusowe, ponieważ ich biologia jest relatywnie prostsza w porównaniu z innymi wektorami wirusowymi. Mają one także zdolność skutecznego wnikania do komórek docelowych gospodarza i łączenia swojego genomu z DNA gospodarza, co daje w konsekwencji możliwość długotrwałej ekspresji genu. Ich główną wadą jest relatywnie mała ilość DNA, którą można w nich ulokować, i zależność od aktywnej replikacji DNA, koniecznej do ich skutecznego przyłączenia. Ta możliwość włączania się (zakażania) tylko do aktywnie dzielących się komórek oznacza, że nie daje się zastosować takiego postępowania w odniesieniu do ostatecznie zróżnicowanych komórek, np. do neuronów. Poza wymogiem podziału komórkowego, wektory retrowirusowe są także względnie niespecyficzne i niestabilne w warunkach in vivo, co powoduje, że komórki docelowe trzeba zwykle wyizolować, i w hodowli poza organizmem, zainfekować retrowirusem zawierającym gen prawidłowy. Zakażone komórki podaje się następnie pacjentowi. Innymi wadami są mała długotrwała ekspresja ludzkiego DNA z wirusowego promotora i przypadkowe miejsce włączenia do genomu gospodarza, co stwarza możliwość wystąpienia przypadkowej wstawkowej mutacji.

Wektory adenowirusowe mogą pomieścić większe ilości egzogennego DNA i mogą zakażać komórki nie dzielące się. Egzogenne DNA jest wprowadzane do infekowanej komórki, ale nie łączy się z genomem gospodarza, co może powodować konieczność ponownego dostarczenia genu, z możliwością wystąpienia stymulacji układu immunologicznego i zmniejszenie efektu klinicznego w długotrwałym leczeniu.

Liposomy są otoczonymi błoną lipidową pęcherzykami zawierającymi roztwór wodny. Liposomy kationowe tworzą kompleksy z DNA, mogą więc zawierać duże ilości egzogennego DNA.

Przy stosowaniu liposomów problemem jest rozpoznanie komórki docelowej i wniknięcie do niej. Pierwsze ograniczenie ominięto poprzez wbudowanie białek specyficznych dla receptorów komórkowych, np. transferyny przy zakażaniu komórek z receptorami transferyny. Drugi problem rozwiązano poprzez wbudowanie do liposomów białek bakteryjnych interaliny i inwazyny, specyficznie łączących się z błoną komórkową, co pozwala kompleksowi na wniknięcie do komórki wejściem bakteryjnym, poprzez receptor powodujący endocytozę albo fagocytozę.

Bezpośrednie wstrzyknięcie materiału genetycznego do pojedynczych komórek jest żmudne, ale ma zastosowanie u zwierząt transgenicznych. Innym możliwym do wykorzystania sposobem jest użycie „pistoletu genowego" (gene guń), który wprowadza cząsteczki złota lub srebra pokryte mikroskopijną warstwą DNA bezpośrednio do skóry albo do głębszych tkanek.

Alternatywne postępowanie polega na modyfikowaniu czynności, wzmożeniu lub zmniejszeniu aktywności endogennych genów. Kilkunukleotydowe sondy są przyłączane specyficznie do komplementarnych sekwencji, co pozwala na blokowanie transkrypcji (postępowanie antygenowe) lub translacji. Sondy te mogą stanowić również „pułapkę molekularną", działającą jak rybosymy i rozdzielającą RNA.

Uzupełnianie genu w chorobach jednogenowych^7-9

Celem terapii genowej jest umożliwienie działania w komórce docelowej kopii genu, która może zastąpić jeden, albo parę zmutowanych genów. W doborze chorób jednogenowych do suplementacji genetycznej należy brać pod uwagę wiele kryteriów. Choroba musi być poważna, z bardzo małymi, albo wręcz bez innych możliwości leczenia i - jak zaznaczono - musi poten-cjalnie poddawać się leczeniu przez podanie dodatkowej kopii prawidłowego genu. Gen ten musi być sklonowany, niezbędna jest znajomość jego sekwencji regulatorowej, a byłoby idealnie, gdyby był mały i nie wymagał bardzo precyzyjnej regulacji. Warunkiem jest również uzyskanie dostępu do tkanek docelowych. Przed próbą zastosowania leczenia u ludzi wskazane jest przeprowadzenie terapii genowej in vivo u zwierząt z niskim poziomem ekspresji genu i/lub eksperymentu in vitro przy użyciu ludzkiej tkanki docelowej. Kilka chorób jednogenowych spełniających te kryteria, stworzyło doskonałe warunki do przeprowadzenia pierwszych prób terapii genowej. Spośród tych chorób wybrano niedobór dezaminazy adenozyny (ADA).

Niedobór ADA powoduje groźną niewydolność układu immunologicznego. Metody leczenia tej choroby są bardzo ograniczone. Za jej wystąpienie odpowiedzialny jest mały gen „housekeeping". Leczenie allogenicznym przeszczepem szpiku kostnego (czyli przez wprowadzenie genetycznie normalnych komórek hemopoetycznych) jest efektywne, jeżeli uda się uzyskać 10-procentową lub nieco większą aktywność ADA. Jest to bardzo korzystne ze względu na możliwość zastosowania komórek poddanych korekcji genetycznej, a pochodzących z allogenicznego przeszczepu szpiku kostnego. Główną wadą ADA w podjętej próbie terapii genowej (oprócz rzadkiego występowania zaatakowanych pacjentów) było to, że najbardziej odpowiednie komórki docelowe, mianowicie komórki pnia szpiku, stanowią tylko 0,01% wszystkich jądrzastych komórek szpiku kostnego i nie dzielą się aktywnie. Leczenie pierwszej dwójki dzieci rozpoczęto w 1990 r. Wyizolowano od nich białe krwinki i potraktowano in vitro wirusem rekombinowanym ADA. Takie poddane transfekcji komórki podano pacjentom. Procedurę przeprowadzano w krwinkach obwodowych, w leukocytach, co pozwalało w razie potrzeby na powtórzenie zabiegu, ale jak wykazały dotychczasowe obserwacje, terapia ta powoduje długotrwały powrót funkcji układu immunologicznego.

Zwłóknienie torbielowate, (mukowiscydoza, cystic fibrosis) powstaje w wyniku niedoboru białka, które aktywizuje zależny od cAMP kanał chlorkowy błony cytoplazmatycznej (cystic fibrosis transmembrane conductance regulator, CFTR). In vitro pojedyncza kopia CFTR może korygować defekt metaboliczny w tej chorobie. Wykazano, że do zachowania funkcji nabłonka jednowarstowowego wystarcza obecność nie więcej niż 10% prawidłowych komórek w jednej warstwie - tzw. efekt towarzyszenia. Adenowirusy w sposób naturalny atakują komórki nabłonka oddechowego i dlatego, tak samo jak liposomy kationowe, są stosowane do transmisji genów w próbach terapii genowej w mukowiscydozie. W terapii tej poczyniono już znaczne postępy, choć nie uniknięto niepowodzeń (np. doprowadzono do wystąpienia uogólnionego zakażenia adenowirusem), i stwierdzono, że nawet wielokrotne podawanie genu nie dopro wadza do jego pełnej integracji z genomem gospodarza.

Terapia genowa w onkologii^10,11

Ponieważ w niektórych stadiach rozwoju większości nowotworów występuje aktywacja dominujących onkogenów i/lub utracenie funkcji genów supresorowych, najbardziej powszechnym zastosowaniem dla terapii genowej w onkologii będzie hamowanie aktywności onkogenu (onkogenów) albo uzupełnianie prawidłowej kopii genu (genów) supresorowego dla nowotworów. Obecnie podstawowym ograniczeniem dla prowadzenia takich działań jest nieumiejętność skutecznego i specyficznego dotarcia in vivo do złośliwych komórek w celu wprowadzenia do nich genu. Inne formy terapii genowej nie wymagają tak wysokiej specyficzności w przenoszeniu genów. Metody te obejmują genetyczną immunostymulację, specyficzną aktywację prekursorów leków w komórkach nowotworowych i ochronę tkanek prawidłowych.

Adoptywna immunoterapia polega na podawaniu osobie chorej komórek układu immunologicznego, co może prowadzić do wystąpienia reakcji skierowanej przeciwko komórkom nowotworu i - w sposób bezpośredni lub pośredni - do efektów przeciwnowotworowych. Podejmowano próby adoptywnej immunoterapii nowotworów przy zastosowaniu cytotoksycznych komórek aktywowanych limfokinami (lymphokineactivated killer, LAK) i z użyciem limfocytów wydzielonych z litego guza (tumor-infiltrating lymphocytes, TIL). TIL były izolowane poprzez hodowanie zawiesiny pojedynczych komórek pochodzących z guza z dodatkiem rekombinowanej interleukiny-2. Terapię genową wykorzystywano zarówno w badaniach, jak i do udoskonalenia terapii adoptywnej. Pierwszy potwierdzony eksperyment transferu genu u ludzi dotyczył TIL zakażonych retrowirusem i był przeprowadzony u chorych z czerniakiem złośliwym.

W eksperymencie tym gen powodujący odporność na neomycynę był wprowadzony do autologicznych TIL wraz z genomem retrowirusa. W ten sposób wyznakowywano genetycznie komórki, co pozwalało na długo trwałą ocenę ich umiejscowienia i przeżywalności. TIL powodują wymierny efekt przeciwnowotworowy, ale są niezdolne do całkowitej likwidacji guza. Próbowano więc wzmocnić ich działanie antynowotworowe poprzez ich transdukcję genem czynnika martwicy nowotworów (tumour necrosis factor, TNF). TNF jest cytokiną, która w sposób bardzo zróżnicowany oddziaływuje biologicznie, przejawiając silną aktywność przeciwnowotworową i właściwości immunomodulacyjne. Ogólne podanie dawek skutecznych terapeutycznie jest ograniczone przez nasilone efekty niepożądane, dlatego powstał pomysł, żeby TIL osiągnęły miejscowo wysokie stężenie TNF. Innym podejściem do genetycznej immunomodulacji jest wprowadzenie genów (np. egzogennych cytokin albo wektorów ekspresji MHC l klasy - białek głównego układu zgodności tkankowej) do komórek rakowych, co może wywołać reakcje immunologiczne przeciwko zmodyfikowanym i nie zmodyfikowanym komórkom guza.

Geny powodujące konwersję nietoksycznego prekursora leku do toksycznych form aktywnych mogą być dostarczane do komórek nowotworowych dwoma sposobami: „samobójczy" gen może być umieszczany pod kontrolą promotora/wzmacniacza, specyficznie aktywnego w komórkach nowotworowych (np. promotor erb B2 w raku gruczołu piersiowego), albo może być w sposób celowany dostarczony do komórek nowotworowych, np. przez wstrzyknięcie bezpośrednio do tkanek guza. Aktywację prekursora leku przez taki gen, który jest specyficznie aktywowany wyłącznie w komórkach nowotworowych, nazwano terapią z zastosowaniem prekursora leku zależnego od enzymu wirusa (virally directed enzyme prodrug therapy, VDEPT). Na przykład wektory wirusa Herpes simplex wykazujące ekspresję genu kinazy tymidyny (HSV-tk) będą, pod kontrolą promotora alfafetoproteiny, specyficznie poddawane ekspresji tylko w komórkach pierwotnego nowotworu wątroby - hepatoma. Kinaza tymidyny może zamienić nietoksyczny prekursor leku arabinonukleozyd 6-metoksypuryny w produkty silnie cytotoksyczne i w ten sposób powodować specyficzną cytotoksyczność dla komórek hepatoma. HSV-tk może zmieniać gancyklowir w toksyczne metabolity. Wykorzystuje się ten fakt poszukując metody leczenia glejaka wielopostaciowego (glioblastomamultiforme) w doguzowym wstrzykiwaniu transgenu w adenowirusach uszkadzających replikację albo liposomach. W początkowym okresie eksperymentowania zaobserwowano klinicznie ważny efekt „towarzyszenia". W mieszaninie komórek nowotworowych, w której tylko połowę poddano transfekcji, po podaniu prekursora leku zginie ponad 90% komórek. W ten sposób otwiera się nowa perspektywa możliwości niszczenia nowotworu bez konieczności dotarcia do każdej złośliwej komórki. Mechanizm tego zjawiska nie jest jasny i być może spowodowany jest przemieszczeniem się toksycznych metabolitów poprzez szczeliny połączeń pomiędzy komórkami nowotworowymi.

W leczeniu nowotworów może być także zastosowany transfer genów somatycznych w celu utworzenia bariery ochronnej przed toksycznością chemioterapeutyków. Ponieważ w leczeniu nowotworów hematotoksyczność jest często czynnikiem limitującym dawki leku, właśnie układ krwiotwórczy był najważniejszym celem dla tego sposobu terapii. Cel ten można osiągnąć poprzez przenoszenie do komórek układu krwiotwórczego genów odporności na leki.

Inne zastosowania^{12, 17}

Jak wspomniano, w ostatnich latach w zakresie terapii genowej dokonała się gwałtowna ewolucja od początkowego zainteresowania rzadkimi chorobami jednogenowymi aż do terapii nowotworów. Obecnie proponuje się wiele sposobów postępowania w szerokim zakresie chorób powszechnie występujących w wieku dojrzałym (np. w zapobieganiu powtórnemu zwężeniu przeszczepów naczyniowych, pobudzaniu rozwoju nowych włókien mięśniowych sercaalbo rewaskularyzacji obszarów niedokrwionych, w postępowaniu antywirusowym albo przywracaniu czynności układu immunologicznego w zakażeniu HIV, w lokalnej ekspresji genów w chorobie Parkinsona). Lista ta gwałtownie się rozszerza i można z dużą dozą prawdopodobieństwa przewidywać, że nieuchronny jest dalszy postęp dotyczący znajomości umiejscowienia i budowy pozostałych genów oraz wyjaśniania ich mechanizmów działania.

Etyczne aspekty terapii genowej¹⁸

Od dawna do leczenia wielu chorób używa się transplantacji tkanek i narządów (włączając wchodzące w ich skład geny). Produkty białkowe otrzymywane z zastosowaniem technik inżynierii genetycznej są wykorzystywane od 1982 r., ale leczenie na poziomie genów z użyciem technologii rekombinacji DNA jest osiągnięciem najnowszym. W 1989 r. został zatwierdzony pierwszy protokół kliniczny, a w 1990 r. po raz pierwszy technikę tę zastosowano w leczeniu (suplementacja genu w niedoborze dezaminazyadenozyny). Od tego czasu po szerokiej debacie publicznej zgodnie ustalono, że terapia genowa etycznie nie różni się od innych sposobów leczenia, ale uzasadniona jest ostrożność w zakresie prób terapeutycznych. Obecnie uważa się, że uznanym sposobem leczenia może być tylko terapia genowa dotycząca bezpośrednio komórek somatycznych. Terapia taka jest niedopuszczalna w odniesieniu do komórek rozrodczych.

Piśmiennictwo: patrz Current Obstetrics & Gynaecology Volume 5) Issue number (4)

powrót do spisu treści

powrót do listy numerów archiwalnych

powrót do strony głównej